A型魏氏梭菌α毒素Asp-56定点突变及其氨基端plc基因表达与特性分析

发布时间：2019-09-02 09:58

【摘要】：A型魏氏梭菌是引起创伤性气性坏疽和人类食物中毒的主要病原菌之一,α毒素是其主要的致病因子。α毒素是一种依赖于锌离子具有磷脂酶C(PLC)活性的金属酶,它具有酶分子的结构特征,其活性部位包括催化位点和结合位点。α毒素第56位天冬氨酸(Asp)是锌离子的结合位点,又是α毒素磷脂酶C的催化位点。国外研究结果初步证实,α毒素的某些氨基酸残基对其具有的生物学活性至关重要,同时其氨基端具有磷脂酶C活性,但尚未开展α毒素的分子结构与生物学活性之间关系的研究。为此,本研究主要开展α毒素催化位点上第56位Asp的定点突变及其氨基端plc基因表达、结构分析和生物学特性研究。一方面,利用PCR定点突变技术,将A型魏氏梭菌α毒素的第56位天冬氨酸(Asp-56)密码子(GAT)定点突变成甘氨酸(Gly-56)密码子(GGT),构建了含α毒素D56G突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(p M-D56G)。通过酶切鉴定和序列分析所得结果可知,含有α毒素D56G突变基因的表达质粒p M-D56G已成功构建。经SDS-PAGE分析,重组菌株BL21(DE3)(p M-D56G)中α毒素D56G突变体蛋白的表达量可达菌体总蛋白相对含量的22.48%。α毒素和α毒素D56G突变体蛋白二级结构的预测使用了EXPASY服务器上的SOPMA法,并同源模建它们的3D结构,结果两者的二级结构均由大量的α螺旋和无规则卷曲组成,两者具有极其相似的3D结构。利用圆二色(CD)光谱仪测定了α毒素和α毒素D56G突变体蛋白的CD光谱,结果两者CD光谱只有一些极小的变化。生物学活性检测结果表明,α毒素D56G突变体蛋白失去了α毒素的磷脂酶C活性。免疫攻毒试验结果显示,α毒素D56G突变体蛋白免疫能够在1MLD的A型魏氏梭菌标准株C57-1的毒素作用下令小鼠存活。另一方面,利用PCR技术选择性的将α毒素氨基端plc基因(PLC1-250)从A型魏氏梭菌α毒素基因中扩增出来,并将其导入重组质粒BL21,从而构建了含α毒素氨基端plc基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(p N-PLC)。通过酶切鉴定和序列分析结果证明,构建的表达质粒p N-PLC中含有α毒素氨基端plc基因。经SDS-PAGE分析,重组菌株BL21(DE3)(p N-PLC)中α毒素氨基端PLC1-250蛋白的表达量为菌体总蛋白相对含量的18.76%。应用EXPASY服务器上的SOPMA法对α毒素和α毒素氨基端PLC1-250蛋白分子进行二级结构预测和同源模建3D结构的结果显示,主要由α螺旋和无规则卷曲组成α毒素和α毒素氨基端PLC1-250蛋白分子的二级结构。α毒素氨基端PLC1-250蛋白的3D结构与α毒素氨基端部分相似。圆二色(CD)光谱分析α毒素和α毒素氨基端PLC1-250蛋白发现,它们的CD光谱相似。对其生物学活性的检测表明,α毒素氨基端PLC1-250蛋白依然保留了α毒素的磷脂酶C活性。总之,上述实验结果为进一步研究A型魏氏梭菌α毒素基因工程亚单位疫苗和α毒素的分子作用机制提供理论和实验依据,对于阐明魏氏梭菌α毒素的致病机制具有重要理论意义和实践价值。
【图文】：

表达质粒,酶切鉴定,毒素,突变体

图 1.1 表达质粒 pM-D56G 的酶切 I; 2.pM-D56G 的 Nco I/EcoR I 酶切; 3.pM-D Nco I/BamH I/EcoR I 酶切; M. QDL2000 DNcation of the recombinant plasmid pM-D56G bycoR I; 2. pM-D56G+NcoI/EcoR I; 3.pM-D56GD56G+NcoI/BamH I/EcoR I; M. QDL2000 DN基因表达产物的 SDS-PAGE 分析毒素 D56G 突变体基因的重组菌株 BL 分析结果表明，α 毒素 D56G 突变体基凝胶成像系统扫描分析，重组菌株 B达量占菌体总蛋白相对含量的 22.48%M 1 2 3

毒素,变体基因,扫描分析,表达质粒

图 1.1 表达质粒 pM-D56G 的 I 酶切 I; 2.pM-D56G 的 Nco I/EcoR I 酶切; 36G 的 Nco I/BamH I/EcoR I 酶切; M. QDL20entification of the recombinant plasmid pM-D556G+EcoR I; 2. pM-D56G+NcoI/EcoR I; 3.pM. pM-D56G+NcoI/BamH I/EcoR I; M. QDL200变体基因表达产物的 SDS-PAGE 分析菌 α 毒素 D56G 突变体基因的重组菌株PAGE 分析结果表明，α 毒素 D56G 突变。经凝胶成像系统扫描分析，，重组菌白表达量占菌体总蛋白相对含量的 22Da M 1 2 3
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

【共引文献】