猪卵母细胞体外培养质量评价指标的研究

发布时间：2019-09-06 07:14

【摘要】：在辅助生殖技术(ART)过程中卵母细胞发育潜力的评估越来越受到关注。生产实践应用上,最佳卵母细胞成熟质量的选择和鉴定,将有助于提高生产胚胎比率和卵母细胞的冷冻保存的效果。取卵过程中卵泡液(FF)或壁层颗粒细胞容易获得,是理论上最优的非伤害性的评价卵母细胞发育潜力生化指标的来源。然而,目前还没找到可以作为衡量卵母细胞发育潜力的可靠标志物质的分子来预测卵母细胞的发育与妊娠。因此,本研究目的是寻找能评价猪卵母细胞发育潜力标志分子的物质。钠肽系统,包括钠肽片段(NPs)和相应的同源受体(NPR)在几个物种中抑制卵母细胞减数分裂来控制卵母细胞的核成熟,然而,NPs与猪卵母细胞的发育潜力关系并不清楚。本研究发现:直径为3.0 - 8.0 mm卵泡的颗粒细胞中NPR2的mRNA水平一直保持稳定的表达,而NPPB和NPPC的mRNA水平随着卵泡直径的增加而增加。在直径3.0 - 6.0 mm的卵泡的卵泡液中BNP和CNP的浓度分别为52 - 58 ng/ml和36 - 43 ng/ml,但是到了直径6.1 - 8.0 rmm的卵泡BNP和CNP的浓度则显著下降,分别为44 ng/ml和35 ng/ml。与此相一致的是,直径3.0-6.0 mm卵泡的卵母细胞经体外培养再经IVF后的卵裂率和囊胚率随卵泡直径增大而增加,但是卵泡直径为6.1 - 8.0 mm的卵母细胞的卵裂率和囊胚率则呈现下降趋势;发生卵裂的单个卵母细胞的卵泡中的BNP和CNP维持在特定浓度(BNP: 45 - 65ng/ml, CNP: 30-45ng/ml)。由此可见钠肽片段的水平对维持卵母细胞的发育潜力起到重要作用,可以作为衡量较大卵泡的卵母细胞发育潜力的标志物。进一步研究表明:100 ng/ml BNP/CNP不同浓度的组合对体外培养的卵母细胞具有相似的减数分裂抑制作用;NPs对不同直径分类卵泡的卵母细胞的影响是不同的,卵母细胞成熟前培养添加BNP或CNP能够提高来自3.0 - 6.0 mm卵泡的卵母细胞的卵裂率和囊胚率,但是不能提高来自6.1-8.0 mm卵泡的卵母细胞的卵裂率和囊胚率。值得注意的是,与对照组相比,通过孤雌激活(PA)和IVF不同的实验都证实来源于3.0 - 4.0 mm的卵泡卵母细胞在含有100 ng/ml的BNP或CNP前成熟培养基中培养20小时卵母细胞的发育潜力提高2-3倍(P0.001)。因此,前成熟培养添加NPs有助于提高来源于猪3.0 - 4.0 mm卵泡的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)体外培养的卵母细胞的发育潜力。此外,我们用流式细胞仪鉴定了不同卵泡中颗粒细胞中生长激素受体(GHR)蛋白表达情况,证实了其基因与蛋白的表达与卵母细胞的发育潜力相关联,GHR可以同时作为反映卵母细胞发育潜力的标志分子。
【图文】：

卵母细胞成熟,卵母细胞,减数分裂恢复

卵细胞内高水平的ｃＡＭＰ可以使ＣＤＫ１上的Ｔｈｒｌ４和Ｔｙｒｌ５位发生磷酸化，从而影逡逑响ＣＤＫ１与周期蛋白Ｂ邋（ＣｙｄｉｎＢ邋）形成复合体，即成熟促进因子，从而使卵母细胞的维持在减逡逑数分裂阻滞状态（Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ邋ｅｔａｌ．，２００２）（图１－２）。当ｃＡＭＰ水平下降时，上述位点会发生去磷逡逑酸化从而形成复合物ＭＰＦ，从而使卵母细胞的减数分裂阻滞状态恢复。另外Ｑ／Ｃ２５６基因敲除逡逑小鼠的卵母细胞不能够激活ＭＰＦ而且卵母细胞不成熟。相关实验表明，磷脂酶ＣＤＣ２５和激酶逡逑ＷＥＥ１／ＭＹＴ１也能使卵母细胞内ＣＤＫ１去磷酸化从而使卵母细胞成熟。因此它们也被证明参与了逡逑卵母细胞减数分裂阻滞（Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００２；邋Ｓａｅｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，，１９９９ａ）。逡逑／逦：＊ｃＡＭＰ＊；＊．逦＼逡逑／邋？？：；？？？？？逦＼逡逑／逦ＰＫＡ逡逑／邋＼逡逑ＷＥＥ１／ＭＹＴ１邋ＣＤＣ２５ｂ－＜Ｐ）逡逑oQ‘，ＭｐＦ”ｙ逡逑Ｍｅｉｏｔｉｃ邋Ａｒｒｅｓｔ逡逑围１－２邋ｃＡＭＰ抑制卵母细胞减数分裂恢复的可能的机制（引自Ｌｉｓａ邋ＭＭｅｈｌｍａｎｎ，邋２００５）逡逑２？次黄嘿呤（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，ＨＸ）逡逑卵母细胞内的ｃＡＭＰ是影响卵母细胞成熟最主要的分子，其在卵母细胞内的含最降低致使卵逡逑母细胞的减数分裂恢复。而ＰＤＥ３Ａ已被证明在卵母细胞内特异性降解ｃＡＭＰ从而引发卵母细胞逡逑的成熟。实验衣明在卵

卵母细胞成熟,信号通路,机制,卵泡液

中国农业大学博士学位论文逦第一章文献综述逡逑图１－．；钠肽阻滞卵母细胞成熟（引自Ｚｈａｎｇ，邋２０１４）逡逑ｌ．ｌ＿４ＨＸ，ＯＭｌ，ＣＮＰ三者之间的关系逡逑目盼认为在卵母细胞减数分裂阻滞中起着重要作用的三种物质ＨＸ，邋ＯＭＩ，ＣＮＰ。ＨＸ邋＋身特逡逑忭决定其没有种属特异忭，而Ｒ．Ｋ能抑制ＰＤＥ３Ａ的活忭，在卵泡液内也能检测到苏存在，因此逡逑ＨＸ在生理情况下是抑制卵母细胞成熟的重要抑制物。但是从卵泡液内除去ＨＸ，卵泡液内依旧逡逑有－－种能抑制卵母细胞成熟的物质，科学家称为ＯＭＩ。ＯＭＩ没有种属特异性，是一种分子量约２逡逑ＫＤ的小分子肽，由颗粒细胞分泌到卵泡液内作用到卵丘细胞抑制卵母细胞成熟。非常有意思的逡逑是近年发现的ＣＮＰ产生的ｃＧＭＰ能非常好的抑制ＰＤＥ３Ａ的活性。ＣＮＰ没有种属特异性。人，逡逑小鼠
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S814

【参考文献】