9种猪病病原体GeXP多重PCR检测方法的研究

发布时间：2019-09-06 08:21

【摘要】：猪圆环病毒二型、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、水疱性口炎病毒、猪水泡病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌以及猪胸膜肺炎放线杆菌等都是临床上较为常见的,传染性强、流行广泛,且危害极为严重的猪病病原体,极大的影响并制约着我国的生猪养殖行业的发展,也对社会公共卫生安全造成了巨大的隐患。这9种疫病常以混合感染的形式出现,临床症状十分复杂,目前的检测手段难以应对。GenomeLab TM GeXP遗传分析系统是一种新型的多基因表达定量分析平台,将GeXP的多重PCR扩增技术与毛细管电泳分析技术相结合,利用带有荧光标记的通用引物和特异性嵌合引物的联合扩增,使目的基因得到高效表达,该技术具有特异性强、灵敏度高、高通量及检测速度快等优点。本研究根据NCBI公布的PCV-2、CSFV、PRRSV、VSV、SVDV、TGE、M.hyo、HPS以及APP的靶基因序列,对保守区基因序列进行分析比对,并设计9对特异性引物,利用常规PCR的单引物单模板和单引物混合模板的双重验证方式,对以上引物进行特异性验证分析;同时利用高效的pMD19-T Simple克隆载体构建9种阳性克隆质粒,应用GeXP技术进行测序分析。结果显示,所设计的引物均具有良好的特异性和敏感性,阳性克隆质粒测序结果均与GenBank所中公布靶基因序列相符,同源性达到99.5%以上。将9对特异性引物其进行优化和修饰,设计出两组GeXP引物:一对加有cy5荧光标记的通用引物和9对特异性嵌合引物,并建立单重GeXP体系、初步构建多重GeXP体系、对多重体系的特异性引物Tm值及特异性引物的含量进行优化,并验证其特异性及灵敏度。结果显示,单重GeXP体系灵敏度可达102copies/μL,灵敏度与Lamp相当,是荧光定量PCR的1000多倍;多重GeXP体系优化结果显示,最优Tm值为58.5℃,最佳特异性引物含量为上下游各0.5μL,在该反应条件下体系对于目的片段的扩增更加的清晰、特异、更易于的判断,同时提高了该体系扩增的稳定性。对其他12种常见畜病病原体的进行特异性验证时,均未发现非特异性扩增,从而进一步证明该多重GeXP体系具有极高特异性;对27份临床样本进行检测,结果显示阳性率为40.7%,与实际的结果相符,证明了该多重GeXP体系具有高准确性及较强的临床实用价值。
【图文】：

系统组成

基因芯片技术因芯片技术是近几年才发展起来的新型的基因检测技术，又称 DNA 芯片片技术的主要原理是通过杂交测序方法，利用一组已知序列的核酸探针进来核酸序列的检测方法。在一块特殊处理的基片表面固定上已知序列的针[99]。并在基片上加入带有荧光标记的核酸序列 TATGCAATCTAG 溶液基因芯片上对应位置的核酸探针反应，从而产生互补匹配时，，就会发出荧察荧光强度大小，找到最强的探针位置，从而获得一组序列完全互补的探据此序列即可重组出靶核酸的序列。基因芯片技术具有高通量、高灵敏性快速简便。但是成本较为高昂，芯片的信号有范围的，计算的表达量反应，基因杂交也会带来相对的误差[100]。eXP 多重基因表达分析系统GeXP 系统的组成及原理

引物,工作原理,嵌合

bTMGeXP 遗传分析系统由是美国 Beckman Coulter 公多基因定量分析表达的平台，该平台具有多种优点，量、高特异性等特点[101]，广泛应用于基因测序分析等施和配套的智能化软件系统，如图 1.1 所示，在图左 Analyzer）设备，在图右侧的就是引物设计及片段分析bTMGeXP 遗传分析系统反应原理是利用一组带有荧扩增的目的基因设计的特异性嵌合引物[102]，在反应进板 DNA/cDNA 进行少量扩增，再结合上游嵌合引物 12 个循环后；由于初始的通用引物的浓度是远远高行反应后嵌合引物的浓度逐步减小，在 13 个循环到通用引物开始进行主导，这样的扩增模式使得靶基因，从而有效的克服了常规的多重 PCR 及荧光 PCR 的了结果中假阳性的产生，提高了检测的准确度。扩增
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28

【参考文献】