猪O型口蹄疫病毒细菌样颗粒疫苗的制备与免疫原性鉴定

发布时间：2019-09-12 11:22

【摘要】：验证基于革兰氏阳性增强基质(Gram-positive enhancer matrix,GEM)展示口蹄疫病毒细菌样颗粒(Bacteria-like particles,BLP)疫苗的可行性。按照大肠杆菌偏好性密码子优化合成基于猪口蹄疫病毒Mya98株序列的3种抗原基因设计,并将其插入到含有锚钩蛋白基因的原核表达载体p QZ-PA,鉴定阳性后转入Escherichia coli BL21,进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因表达及产物的可溶性进行分析。利用GEM颗粒纯化目的蛋白,制备细菌样颗粒疫苗抗原;利用BCA试剂盒测定重组蛋白的浓度,将重组蛋白与白油佐剂乳化,制备疫苗,免疫5周龄小鼠,同时设商品化多肽苗对照与空白对照,免疫后不同时间采集试验小鼠血清,利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗体检测试剂盒和O型口蹄疫抗体液相阻断酶联免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒检测免疫小鼠血清的抗体水平;利用噻唑蓝比色法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)测定淋巴细胞增殖情况;利用荧光定量PCR方法检测相关细胞因子表达,评价细胞免疫水平。SDS-PAGE结果表明,设计在大肠杆菌中的3种口蹄疫病毒抗原基因均以可溶形式获得高效表达;Western blotting结果显示,表达的重组蛋白能够与口蹄疫病毒阳性血清发生反应,利用GEM颗粒能够实现重组蛋白的一步离心纯化,制备BLP疫苗抗原;免疫试验结果表明,设计的重组抗原B(T1BT2)4B不但能够刺激免疫小鼠产生更高水平的多肽特异性ELISA抗体与口蹄疫特异性液相阻断抗体,而且产生了更高水平的脾淋巴细胞增殖及Th1型的细胞因子分泌。初步实验结果表明,本研究制备的BLP疫苗GEM-B(T1BT2)4B具有良好的免疫原性,为研究口蹄疫病毒基因工程亚单位疫苗开辟了一条新的思路。
【图文】：

ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechFebruary25,2017Vol.33No.2http://journals.im.ac.cn/cjbcn222预期设计的目的基因片段一致。2.2重组蛋白的表达及可溶性分析鉴定正确的重组表达质粒转化BL21感受态细，在含有氨苄青霉素的LB平上挑取单个菌落培养。取菌到含有氨苄青霉素的LB体培养基中，37℃培养到细菌浓度达到OD600为0.51时加终浓度为0.4mmol/L的IPTG，诱导24h后，菌离去培养基，用PBS重悬菌体后经高压破碎仪破碎菌体，用SDS-PAGE检测表达产物(图1)，3个融合蛋白都可以表达，分子分约为47、28与36kDa，^u且3个蛋白均以可溶性形式存在于菌体破碎的上清中。图1重组蛋白表达及可溶性分析结果Fig.1ExpressionandsolubilityidentificationoftherecombinantproteinwithSDS-PAGE.M:proteinmolecularmarker;1:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;2:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-B(T1BT2)4B-PA;3:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-B(T1BT2)4B-PAtransformedBL21;4:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-B(T1BT2)4B-PAtransformedBL21aftersupersonic;5:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;6:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT1B-PA;7:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21;8:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21aftersupersonic;9:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;10:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT2B-PA;11:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21;12:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21aftersuperson

PAtransformedBL21;8:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21aftersupersonic;9:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;10:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT2B-PA;11:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21;12:sedimentforrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21aftersupersonication.2.3重组蛋白表达产物的Westernblotting鉴定经SDS-PAGE泳后，转印至PVDF膜，用鼠抗O型FMDV肽阳性血清对表达产物徻行Westernblotting鉴定，结果如图2所示，在PVDF膜上获得的带与SDS-PAGE表达的蛋白带一致，这表明表达的重组蛋白可被特异性的抗体所识，具有较好的抗原性。2.4GEM纯化目的蛋白的SDS-PAGE鉴定如图3所示，，用SDS-PAGE可检测到较高纯度目的蛋白的存在，纯化后pQZ-BT1B-PA重组蛋白浓度为85μg/mL；纯化后pQZ-BT2B-PA重组蛋白浓度为213μg/mL；纯化后pQZ-B(T1BT2)4B-PA重组蛋白浓度为870μg/mL；用透镜观察可见，与未结合前的GEM比，结合重组蛋白后的GEM颗粒有很不壝则的细成团结合物，可是蛋白形成了聚体(图4)。图2重组蛋白的Westernblotting鉴定结果Fig.2Westernblottinganalysisofrecombinantprotein.M:proteinmolecularmarker;1:blankcontrolofBL21transformedwithplasmidpQZ;2:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT1B-PA;3:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT1B-PAtransformedBL21;4:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-BT2B-PA;5:supernatantofsupersonictreatedrecombinantplasmidpQZ-BT2B-PAtransformedBL21;6:wholebacteriumofBL21transformedwithpQZ-B(T1BT2)4B-PA;7:supernatantofsupersonicated
【作者单位】： 安徽农业大学动物科技学院;国家兽用生物制品工程技术研究中心;江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心;
【基金】：公益性行业(农业)科研专项(No.201303046) 江苏省农业自主创新专项(No.CX(14)2089)资助~~
【分类号】：S852.4

【参考文献】

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本文编号：2535095