犬细小病毒北京分离株的鉴定及其全基因组序列分析

发布时间：2019-09-12 16:09

【摘要】：首先对疑似犬细小病毒(CPV)感染的病犬粪便进行特异性PCR扩增,经目的片段测序分析,初步证明为CPV感染。将该病犬粪便处理物接种F81细胞,自第3代起,细胞出现典型CPE。对该株病毒进行电镜观察、理化特性试验、HA-HI及基因型等方面鉴定,证明该分离株为CPV,命名为CPV/BJ-L1株。该分离株的血凝效价为1∶512,其血凝性能被特异性抗体抑制;Reed-Muench法测定分离株病毒TCID_(50)为10-5.15/0.1 mL;电镜观察可见25nm左右的病毒颗粒;动物回归试验显示,攻毒犬能复制出CPV的典型临床症状和病理变化;对分离株的全基因组(包含两端完整的发夹结构序列)进行克隆、测序与分析。结果表明,BJ-L1为CPV-2a亚型,与GenBank中的21株CPV全基因序列核苷酸同源性为98.8%~99.8%,且与国内近期分离毒株高度同源。对2006-2014年北京市CPV分离株VP2基因进行序列分析,结果显示,CPV流行株的变异具有某种时间相关性。
【图文】：

细胞病变,细胞的,引物,病毒

ＰＵ１和ＰＵ２扩增基因组５′Ｕ型结构，所有引物均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。表１ＣＰＶ全基因克隆引物引物名称上游引物（５′→３′）下游引物（５′→３′）编码区Ｐ１ＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＡＴＴＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＰ２ＴＴＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＴＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴＰ３ＴＴＡＡＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣＴＴＡＴＧＧＴＡＡＧＧＴＴＡＧＴＴＣＡＣ３′ＹＰＹ１ＡＴＴＣＴＴＴＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＣＧＣＧＴＣＡＴＣＡＣＧＴＣＡＴＰＹ２ＧＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＣＣＧ５′ＵＰＵ１ＧＡＡＣＴＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＴＡＡＧＴＡＣＧＴＡＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＰＵ２ＣＴＡＣＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＣＴＴＴＡＡＧＧＧＧＧＧ１．１２．２病毒ＤＮＡ提取取１００μＬ病毒样品，按照ＤＮＡ提取试剂盒说明书提取ＤＮＡ。１．１２．３病毒全基因的克隆与测序病毒编码区反应体系为２５μＬ：模板ＤＮＡ２μＬ，２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＣＢｕｆｆｅｒ１２．５μＬ，ｄＮＴＰ２．０μＬ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），上下游引物各０．５μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ），ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．５μＬ（２．５Ｕ／μＬ），ｄｄＨ２Ｏ７．０μＬ。９８℃５ｍｉｎ；９８℃１０ｓ，，５５℃２０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，共３０个循环；最后７２℃１０ｍｉｎ。反应结束后进

形态图,病毒粒子,电镜,形态

图３电镜下病毒粒子形态２．３病毒ＨＡ－ＨＩ试验结果ＣＰＶ／ＢＪ－Ｌ１株第５代病毒的血凝效价为１∶５１２。ＨＩ试验结果显示，病毒对１％猪红细胞的凝集特性可被ＣＰＶ单克隆抗体抑制。２．４病毒ＴＣＩＤ５０的测定结果按Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法计算ＣＰＶ／ＢＪ－Ｌ１株病毒的ＴＣＩＤ５０为１０－５．１５／０１．ｍＬ。２．５病毒理化试验结果用５－ＢＵＤＲ处理过的ＣＰＶ的ＴＣＩＤ５０为１０－１．８５／０．１ｍＬ为比对照组低２．３个数量级，说明５－ＢＵＤＲ可明显抑制ＣＰＶ增殖。经乙醚、酸（ｐＨ＝３．０）、加热处理后，病毒的ＴＣＩＤ５０无明显变化，经过处理的与未经处理的病毒的ＴＣＩＤ５０相差均小于１个数量级，说明分离到的病毒对有机溶剂、热和酸有较强的抵抗力，这与ＣＰＶ理化特性一致。２．６动物回归试验结果２只犬分别在攻毒后第４，６天开始表现食欲减退，精神沉郁，腹泻，血便（图４），体温并无明显升高。第７，９天先后死亡，剖检后可见空肠、回肠弥散性出血、肿胀，肠黏膜脱落，肠腔内充满血样粪便（图５），而对照组２只犬没有表现任何临床症状，结果证明本试验分离株ＢＪ－Ｌ１为强毒株。图４攻毒第６天血便图５剖检后肠道病变２．７病毒全基因组克隆结果及序列分析ＣＰＶ／ＢＪ－Ｌ１株全基因ＰＣＲ扩增结果如图６，７所示，ＢＪ－Ｌ１序列总长为５０５６ｂｐ，其中３′Ｙ型结构全长１２０ｂｐ，５′Ｕ型结构全长１８８ｂｐ；ＯＲＦ１全长２００７ｂｐ
【作者单位】：中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室;
【基金】：国家863计划资助项目(2011AA10A213)
【分类号】：S852.655

【参考文献】