褪黑素对牛卵泡内膜细胞凋亡和类固醇生成的作用研究

发布时间：2019-09-15 21:03

【摘要】：卵泡内膜细胞凋亡及类固醇生成在卵泡发育和闭锁过程中发挥了重要作用。褪黑素调控卵泡内膜中凋亡和类固醇生成的具体机制目前还不清楚,该研究对于进一步阐明褪黑素在卵泡发育和闭锁中的调控作用,促进卵泡体外培养和应用具有重要意义。本研究选择牛3-4 mm卵泡在体外研究褪黑素对卵泡内膜细胞类固醇生成及卵泡内膜细胞凋亡的影响,并进一步阐明具体的调控机制。研究结果如下:1.褪黑素对牛卵泡内膜细胞凋亡与类固醇生成的影响用0 ng/mL,1 ng/m L,10 ng/m L,100 ng/mL的褪黑素处理卵泡,撕取卵泡内膜,RT-qPCR检测卵泡内膜细胞褪黑素受体MT1、MT2的表达,结果显示10 ng/m L的褪黑素对褪黑素受体MT1、MT2的促进效果最明显。卵泡培养液中添加10 ng/mL的褪黑素处理,RT-qPCR检测撕取的卵泡内膜LHR,类固醇生成相关基因及凋亡基因BCL2、BAX、CASPASE的表达,Elisa检测卵泡培养上清中雄烯二酮和孕酮的分泌。结果显示褪黑素显著促进LHR和STAR的表达,显著促进孕酮的分泌,显著促进抗凋亡基因BCL2的表达,BCL2和BAX比率增加。用10 ng/mL褪黑素处理体外培养的卵泡内膜细胞,使用TUNEL染色法检测细胞的凋亡情况,染色结果显示褪黑素处理组的凋亡率低于对照组。本研究表明褪黑素影响卵泡中卵泡内膜细胞类固醇的生成,抑制卵泡内膜细胞的凋亡。2.MT1和MT2介导褪黑素对卵泡内膜细胞凋亡与类固醇生成的作用在含有10 ng/m L褪黑素的卵泡培养液中添加10μM褪黑素受体非特异性的抑制剂Luzindole或10μM MT2特异性抑制剂4P-PDOT处理,RT-qPCR检测撕取的卵泡内膜细胞褪黑素受体MT1、MT2和LHR、STAR,抗凋亡基因BCL2的表达,Elisa检测卵泡培养上清中孕酮的分泌。结果显示,添加Luzindole后显著抑制褪黑素诱导的MT1和MT2的表达,添加4P-PDOT后显著抑制MT2的表达;添加Luzindole或4P-PDOT处理均显著抑制褪黑素诱导的LHR、STAR、BCl2的表达;添加Luzindole处理显著抑制孕酮的分泌。本研究表明MT1和MT2介导褪黑素对卵泡内膜细胞凋亡和类固醇生成的调控作用。3.PI3K/AKT通路介导褪黑素对卵泡内膜细胞凋亡与类固醇生成的作用在含有10 ng/mL褪黑素的卵泡培养液中添加25μM通路抑制剂LY294002处理,RT-qPCR检测撕取的卵泡内膜细胞LHR、STAR及抗凋亡基因BCL2的表达,Elisa检测卵泡培养上清中孕酮的分泌。结果显示添加LY294002处理显著抑制褪黑素诱导的LHR、STAR和BCL2的表达,添加LY294002处理显著抑制孕酮的分泌。研究表明PI3K/AKT通路在褪黑素介导卵泡内膜细胞凋亡与类固醇生成中起到一定的调控作用。结论:MT1/MT2和PI3K/AKT信号通路介导褪黑素调控牛卵泡内膜细胞凋亡与类固醇生成。
【图文】：

褪黑素,信号通路

第二章褪黑素的研究进展成中的作用仍所知甚少。本研究的目的意义本研究在体外条件下利用褪黑素处理牛 3-4 mm 的卵泡，研究褪黑素对卵固醇生成及卵泡内膜细胞凋亡的影响，并进一步阐明具体的调控机制。该步阐明褪黑素在卵泡发育和闭锁中的调控作用，促进卵泡体外培养和应用。

卵泡,卵泡壁,内膜,颗粒细胞

图 3-1 牛小腔卵泡的分离细胞完整，卵泡内膜血管不丰富；B: 卵泡壁颗粒细胞不完整，卵泡内膜细胞完整，卵泡内膜血管丰富；D: 卵泡壁颗粒细胞不完整，卵泡内膜Fig.3-1 The separation of bovine small antral follicleith complete granulosa cells and poor blood vessels; B: Follicles with incom blood vessels; C: Follicles with complete granulosa cells and rich blood vessete granulosa cells and rich blood vessels膜胞纯度鉴定图 3-1C 所示，健康的没有明显凋亡现象的卵泡，分离卵泡内胞，使用 RT-PCR 的方法鉴定卵泡内膜细胞细胞特异基因及颗（图 3-2），，鉴定结果显示分离的卵泡内膜表达膜细胞特异基因细胞特异基因 FSHR。胶原酶法分离卵泡内膜细胞，体外培养所使用的一抗是 CYP17a1 和 FSHR。鉴定结果显示膜细胞白，而不表达 FSHR 蛋白(图 3-3)，统计结果显示膜细胞的阳
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S823

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