禽致病性大肠杆菌信号分子AI-2受体检测方法建立及其靶蛋白鉴定

发布时间：2019-09-20 17:32

【摘要】：禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可感染鸡、鸭、火鸡和其他禽类,使宿主出现气囊炎、蜂窝组织炎、输卵管炎、腹膜炎等症状,是养禽业最常见的致病菌之一。LuxS/AI-2型密度感应系统广泛存在于革兰氏阳性和阴性细菌中,可产生种间通用信号分子AI-2,并调控细菌的多种生理功能。AI-2信号由胞外转运至胞内需要借助于细胞的AI-2受体,目前哈维氏弧菌的LuxP型受体和鼠伤寒沙门的LsrB型受体已被证实存在多种细菌中。但关于APEC的AI-2受体,目前尚缺乏相关报道。本研究旨在通过建立APEC的AI-2受体检测方法,运用蛋白组学技术,筛选AI-2调控的靶蛋白,为进一步探究LuxS/AI-2型密度感应系统在APEC中的调控通路及鉴定AI-2受体提供参考,从而为从细菌群体角度防治APEC提供新的思路。1.AI-2受体蛋白检测的方法建立为了建立AI-2受体检测方法,本研究首先通过基因缺失的方法,构建大肠杆菌BL21(DE3)的luxS基因缺失株,成功获得不能产生AI-2的BL21(DE3)缺失株,并命名为BL21(DE3)?luxS。运用pColdTF质粒构建了鼠伤寒沙门氏菌LsrB蛋白的原核表达载体pColdTF-lsrB,并分别转化至BL21(DE3)?luxS和BL21(DE3)中,经体外诱导表达,成功获得具有生物学活性的Lsr B蛋白。运用纯化的LsrB对AI-2分子进行了结合与释放实验。实验结果表明LsrB对AI-2分子具有结合能力,且结合能力是建立在LsrB的活性结构基础上;活性结构丧失后的LsrB不能够结合AI-2,并释放已结合AI-2。通过建立AI-2受体的检测方法,为进一步开展APEC的AI-2受体筛选奠定基础。2.运用蛋白组学技术筛选APEC中AI-2的靶蛋白对APEC内化外源性AI-2的动力学研究表明,加入AI-2后第3 h时,APEC对AI-2内化效率最高(72%)。但运用荧光定量PCR(qPCR)技术,对APEC内化外源性AI-2后luxS、pfs、iss和tsh的转录水平检测结果表明,AI-2内化5h时,上述基因转录水平变化最显著(p0.001)。上述研究结果表明从APEC对AI-2的内化和AI-2对APEC的基因调控是不同步的。为了研究AI-2对APEC的靶蛋白的调控作用,本研究结合APEC内化外源性AI-2的内化动力学结果,选择AI-2加入APEC中5 h时的菌体,运用非标记定量蛋白组学方法检测受AI-2调控靶蛋白,同时设立不加AI-2的APEC对照组,比较两者蛋白表达差异,筛选APEC中受AI-2调控的靶蛋白。非标记定量蛋白质组学结果显示共检测到受AI-2调控的显著性差异蛋白质479个,对差异蛋白的生物信息分析结果表明,受AI-2调控的靶蛋白主要参与APEC的代谢和信号转导过程。3.AI-2靶基因缺失株的构建及生物学特性分析对运用蛋白组学技术筛选到的AI-2靶蛋白进行分析,选取5个受AI-2调控的靶蛋白基因(3630、tufB、phoH、kgtP和yjaE),运用Red同源重组的方法,成功获得上述基因的缺失株。对构建的缺失株进行AI-2内化检测,结果表明,与野生株相比,上述基因的缺失,并不能显著影响AI-2的内化。本文推测选取的5个AI-2靶基因,不是APEC的AI-2受体基因,不参与APEC对AI-2的内化。对缺失株的LD50检测结果表明,缺失株对樱桃谷鸭的致病能力未呈现明显变化(出现10倍或以上的LD50变化可认为毒力改变),表明本研究选取的5个AI-2靶基因,不参与对APEC的毒力调控。本研究结果表明,选定的该5个AI-2调控基因可能参与APEC中的某些受LuxS/AI-2型密度感应调控的其他生理过程,具体的机制仍有待深入研究。本研究通过建立AI-2受体检测方法、鉴定AI-2调控的靶蛋白和构建靶基因的缺失株并开展相关的生物学研究,为进一步开展APEC中AI-2受体及其调控作用提供参考。
【图文】：

图 1：细菌密度感应（QS）信号的四个典型传导路线[17]Fig 1: Canonical bacterial quorum-sensing (QS) circuitsA：革兰氏阳性菌 QS 系统的 AIP 分子双组分信号传导；B：革兰氏阳性菌 QS 系统的 AIP 结合转录因子传导；C：在革兰氏阴性菌 QS 系统的 LuxI/LuxR 型小分子传导系统；D：在革兰氏阴性菌 QS 系统的双组分信号传递。革兰氏阳性菌产生的自诱导物是一种小肽，被称为自诱导肽（Autoinducingpeptides, AIPs）。革兰氏阳性菌的 QS 系统通过对 AIPs 的产生、识别和生理反应的控制，来实现其调控作用。在许多革兰氏阳性菌中，寡肽信号分子 AIPs 是由膜上的双组分信号转导系统识别（图 1A）[19-21]。革兰氏阳性菌的 QS 系统的 AIPs 通常是先形成前体（proAIPs），而编码 proAIPs的基因大多分散在基因组中[19, 22-27]。AIPs 在胞内产生，随即被传递并外排出胞膜。当 AIP 的胞外浓度高时（发生于 HCD），它会与胞膜上一种双组分组氨酸激酶受体结合。通常，AIP 结合后激活受体的激酶活性，使其磷酸化，并将磷酸基团传递给胞质内的相应调控分子。这种一系列的磷酸化反应能够调节与激活 QS 系统中的基因转录（图 1A）。在某些革兰氏阳性细菌的 QS 中，AIPs 会被输送回进细胞的细胞质，进而与胞质中的转录因子相互作用，以调节转录因子的活性，进而调节基因表达的变

图 2：革兰氏阴性菌不同菌种产生的 AHL 同系物Fig 2: Homoserine lactone autoinducers produced by different Gram-negative bacteria注：LuxI、LuxM、RhlI、LasL 均为 LuxR 的同源蛋白当前已有一些 AHL 介导的群体感应系统被研究的很深入，如绿脓杆菌的LasI/LasR-RhlI/RhlR 系统被证实控制毒力因子基因的表达和生物被膜的形成[54-57]，根瘤农杆菌的 TraI/TraR 系统控制着向植物宿主传送致癌 Ti 质粒[44, 58, 59]，玉米细菌性枯萎病菌的 EsaI/EsaR 系统控制多糖的合成、粘附和对宿主细胞的定植[60, 61]。2.2 细菌种间的密度感应系统—LuxS/AI-2 型密度感应系统虽然 LuxI/LuxR 型系统已在大多数革兰氏阴性被证实，但对某些弧菌（如哈维弧菌和霍乱弧菌）的研究发现它们的 QS 系统不符合 LuxI/LuxR 型系统的特性。这两种弧菌（哈维弧菌和霍乱弧菌）既没有 LuxI 同源基因，也不存在 LuxR 同源基因。然而，哈维弧菌和霍乱弧菌却存在群体感应系统所需的组件，，并且两者高度类似[62-66]，这提示可能存在其他类型的 QS 系统。起初，人们在对哈维弧菌的生物发光研究中首次发现了 AI-2[67]。进一步研究表明 AI-2 广泛存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及在
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

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本文编号：2538939