利用MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞的研究

发布时间：2019-09-21 11:07

【摘要】：已有研究证实,绵羊脐带间充质干细胞具有向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞、肝脏细胞和成肌细胞等分化的潜能。为了建立诱导绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞的方法,本研究在构建小鼠MyoD-pcDNA3.1真核表达载体的基础上,转染至绵羊脐带间充质干细胞进行诱导。对诱导细胞进行细胞形态学、蛋白表达以及基因表达等检测,以期最终获得绵羊成肌细胞。本研究中获得结果如下：1.小鼠MyoD基因的克隆参照GenBank中的小鼠MyoD基因序列(NM_010866),采用RT-PCR扩增技术,克隆小鼠Myo D基因,将其连接到pcDNA3.1 (+)载体,获得MyoD-pcDNA3.1真核表达载体：将获得的MyoD-pcDNA3.1转染到小鼠胎儿成纤维细胞中,采用Real-Time PCR、免疫荧光、流式细胞分析等进行活性检测。其结果,MyoD-pcDNA3.1在小鼠胎儿成纤维细胞中具有表达活性；2.MyoD-pcDNA3.1转染绵羊脐带间充质干细胞将冷冻保存的绵羊脐带间充质干细胞复苏培养,当细胞达到约80%汇合时,分别进行下列处理：1)采用脂质体转染法将MyoD-pcDNA3.1无内毒素质粒转染细胞,并在培养基中添加DMSO作为诱导剂诱导培养(A组)；2)采用脂质体转染法,转染MyoD-pcDNA3.1无内毒素质粒(B组)；3)用添加有DMSO诱导剂的培养基进行培养(C组)。在经上述三种处理后,分别对诱导细胞进行如下检测：(1)细胞形态学检测经3种诱导处理后的第12d,在倒置荧光显微镜下观察,3组细胞均由长梭形转变成细长的成肌细胞状态,即细长管状,旋涡状逐渐消失。(2)免疫荧光检测在上述各组在开始处理后的第8d,利用MyoD 和 Desmin抗体进行检测,其结果,虽然3种处理组细胞的MyoD均呈现阳性表达,但与A和B组相比,C组的MyoD表达量较低；3种处理组的细胞均表达Desmin,且其表达量无明显差别；在第16d,利用MyoD、MyoG 和 Desmin抗体进行检测,在3种处理组的MyoD相对表达量与第8d检测时相比均有所下降,MyoG蛋白的表达量较弱,而Desmin的表达量与第8d检测时相比无明显差异。(3)流式细胞检测采用流式细胞仪进行检测结果,上述3种处理组的细胞均表达成肌细胞特异因子MyoD、Desmin和MyoG,且3种蛋白的阳性细胞率均达到86.6%以上(A组分别为98.6%、99.0%和99.0%；B组分别为93.5%、99.5%和97.4%；C组分别为99.3%、99.5%和86.6%)。(4) Real-Time PCR采用Real-Time PC R方法,对上述3种处理组细胞的MyoD、 MyoG和Desmin的相对表达量进行检测,其结果,与转染前细胞(标准化为1)相比,上述3种处理组的MyoD、MyoG和Desmin勺相对表达量与均升高(A组分别为3.217+0.01倍、4.345+0.01倍和5.107+0.01倍；B组分别为2.046±0.01倍、2.389+0.01倍和5.489+0.01倍；C组分别为3.713+0.01倍、1.861土0.01倍和5.271士0.01倍)。上述结果表明,本研究利用小鼠MyoD基因构建的MyoD-PcDNA3.1真核表达载体可以诱导绵羊脐带间充质干细胞为成肌细胞,为进一步研究成肌细胞对肌损伤修复的作用奠定基础。
【图文】：

间充质干细胞,绵羊

３．３．１绵羊巧带间充质干细胞的培养逡逑将冷冻保存绵羊巧带间充质干细胞复苏，进行传代培养。当传代培养至第２代时，，逡逑呈现长梭形旋祸状排列（图３－１），对其续培养的第２ｄ，细胞达到约９０％Ｗ上汇合（图逡逑３－２）。逡逑WW逡逑图３－１绵羊巧带间充质干细胞Ｐ２（５0ｘ）逦图３－２绵羊厮带间充质干细胞Ｐ３（Ｓ0ｘ）逡逑３．３．２绵羊骄带间充质干细胞的转染及诱导分化逡逑３．３．２．１绵羊巧带间充质干细胞的转染逡逑为了检测绵羊厮带间充质干细胞的转染效率，实验采用脂质体转染的方法将逡逑ＭｙｏＤ－ｐｃＤＮＡ３．１质粒转染至绵羊巧带间充干细胞，对照组为转染ＧＦＰ质粒的细胞，转逡逑染２４ｈ后观察绿色巧光的数量，Ｗ检测和记录转染效率。其结果，２４ｈ后巧光倒置显微逡逑镜下可观察到部分细胞发出绿色巧光（图３－３、图３－４），４化时巧光数量增加亮度增强逡逑（图邋３－５、图邋３－６）。逡逑－２９－逡逑

间充质干细胞,绵羊

３．３．１绵羊巧带间充质干细胞的培养逡逑将冷冻保存绵羊巧带间充质干细胞复苏，进行传代培养。当传代培养至第２代时，逡逑呈现长梭形旋祸状排列（图３－１），对其续培养的第２ｄ，细胞达到约９０％Ｗ上汇合（图逡逑３－２）。逡逑WW逡逑图３－１绵羊巧带间充质干细胞Ｐ２（５0ｘ）逦图３－２绵羊厮带间充质干细胞Ｐ３（Ｓ0ｘ）逡逑３．３．２绵羊骄带间充质干细胞的转染及诱导分化逡逑３．３．２．１绵羊巧带间充质干细胞的转染逡逑为了检测绵羊厮带间充质干细胞的转染效率，实验采用脂质体转染的方法将逡逑ＭｙｏＤ－ｐｃＤＮＡ３．１质粒转染至绵羊巧带间充干细胞，对照组为转染ＧＦＰ质粒的细胞，转逡逑染２４ｈ后观察绿色巧光的数量，Ｗ检测和记录转染效率。其结果，２４ｈ后巧光倒置显微逡逑镜下可观察到部分细胞发出绿色巧光（图３－３、图３－４），４化时巧光数量增加亮度增强逡逑（图邋３－５、图邋３－６）。逡逑－２９－逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826

【参考文献】