表达传染性喉气管炎病毒gB、gD基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗毒株构建及其免疫效力试验

发布时间：2019-10-08 02:54

【摘要】：传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus, ILTV)所引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病,给世界范围内的养鸡业造成了巨大经济损失。目前,国内外预防本病主要依靠弱毒疫苗,但弱毒疫苗的毒力偏强,接种后往往出现不良反应；另外,由于ILTV可以潜伏感染,弱毒疫苗在鸡群传播过程中会发生毒力返强。对国内部分地区ILT的流行病学研究发现,ILT的暴发可能与弱毒疫苗有关。因此,研制安全有效的基因工程疫苗已成为人们的共识。本研究以ILTV Anhui-2011株为模板扩增gB、gD基因,然后分别将其克隆至含有火鸡疱疹病毒(HVT) FC-126疫苗毒株基因组US2序列的转移载体(pUp-Down)中,构建转移质粒pUp-gB-Down、pUp-gD-Down。随后将含有LTR启动子和EGFP报告基因的表达盒分别克隆至上述转移质粒中,构建HWT转移载体pHVT-gB、pHVT-gD。采用磷酸钙转染法将转移载体与HVT基因组共转染CEF次代细胞,获得带有绿色荧光标记的重组病毒。提取重组病毒基因组,用Cre重组酶敲除EGFP报告基因,通过再次转染CEF次代细胞,获得仅带有LTR启动子和目的基因的重组病毒rHVT-gB、rHVT-gD。通过PCR和Western-Blot试验对重组病毒进行鉴定,结果表明目的基因gB、gD成功插入HVT基因组中,并能正确表达gB、gD蛋白。重组病毒对ILT的免疫保护试验：将90只1日龄SPF鸡随机分为5组,第1、2组为重组病毒免疫组,第3组为攻毒对照组,第4组为弱毒活疫苗对照组,第5组为空白对照组。弱毒疫苗免疫3周后,除空白对照组,各试验组均气管内接种105EID50ILTV强毒,继续观察10天。统计分析各组临床症状、攻毒前后鸡体增重、发病率死亡率、抗体消长及病理组织学变化。结果显示：攻毒后第二天即有鸡发病,临床症状高峰期出现于攻毒后第四天。重组病毒rHVT-gB的发病率为20%,死亡率为5%,免疫保护高于弱毒苗组,差异显著(p0.05)；重组病毒rHVT-gD的发病率为30%,死亡率为15%,免疫保护高于弱毒苗组,但差异不显著(p0.05)。结果表明,1日龄SPF鸡接种重组病毒后能建立起针对ILT强毒株的有效保护,且rHVT-gB明显比rHVT-gD组免疫保护效果好。重组病毒对MD的免疫保护试验：将60只1日龄SPF鸡随机分为4组,第1、2组分别为重组病毒免疫组,第3组为FC-126疫苗组,第4组为攻毒对照组。免疫1周后,各试验组均腹腔接种5000 PFU MDV超强毒株RB1B。攻毒后每天观察鸡群至90日龄。结果显示,重组病毒与亲本毒株FC-126均可对MD超强毒株的攻击产生有效免疫保护,说明外源基因的插入并不影响亲本毒株的免疫保护效力。
【图文】：

图１－１邋ＩＬＴＶ结构示意图逡逑

图１－２邋ＩＬＴＶ电镜照片逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｉｏｎ邋ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ邋ｏｆ邋ＩＬＴＶ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：2546061