猪伪狂犬病毒GDHD-1株的分离鉴定与致病性研究

发布时间：2019-10-13 18:19

【摘要】：猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的一种高度接触性传染病。该病在全球范围内广泛分布,可引起种猪繁殖障碍,仔猪呼吸道综合征、神经症状、腹泻、生长发育受阻等主要症状,对养猪业造成巨大的经济损失。近年来,该病继续发生与流行,推测新的流行毒株抗原性发生较大变异,且致病力强,现有的疫苗不能完全保护流行毒株的感染。因此,为有效防控该病流行,需要研制针对流行毒株的疫苗。2014年广东某猪场保育仔猪大量死亡,发病症状与PRV感染相符。本研究对该猪场PRV野毒株进行分离鉴定,并研究其致病性,为研制针对新流行毒株的疫苗奠定基础。1.广东一株猪伪狂犬病毒的分离鉴定采用PCR、非洲绿猴肾(Vero)细胞感染、间接免疫荧光、电镜观察等方法,从广东某猪场疑似PRV感染的猪群中分离鉴定病毒。在处理的脑组织病料中PCR扩增出PRV野毒株gE基因特异性产物,提示该猪群受PRV野毒感染。将病料上清接种Vero细胞,36h后细胞呈现变圆、膨胀、聚集脱落等典型细胞病变,再经PCR检测到gE基因特异性产物。将接种病毒的Vero细胞,用PRV阳性血清进行间接免疫荧光检测,感染细胞出现特异性荧光。将病毒液负染后,在透射电镜下观察到直径为150nm左右病毒颗粒,呈球形,有囊膜,囊膜外有明显的呈放射状的纤突,呈现PRV典型的病毒颗粒。将病毒感染Vero细胞进行滴度检测,滴度为107.25TCID50/ml。对病毒gE基因进行同源性分析,结果显示该分离株与参考毒株gE基因同源性在97.5%～99.9%之间,与我国2013-2014年间新分离的强毒株具有相近的遗传进化亲缘关系。上述结果表明,该猪群受PRV野毒感染,并将分离的PRV野毒命名为GDHD-1株。2.猪伪狂犬病毒分离株GDHD-1的致病性研究分别用新西兰白兔、仔猪分析PRVGDHD-1的致病性。选用6只10周龄健康新西兰白兔,其中2只皮下注射2ml107TCID50的病毒液,2只皮下注射2ml106TCID50的病毒液,2只对照组皮下注射2ml无菌生理盐水。结果显示4只接种PRV GDHD-1的新西兰白兔在攻毒24h后出现明显的瘙痒和神经症状,48～72h后全部死亡,且高滴度病毒攻毒组致死速度明显快于低滴度病毒攻毒组,证实PRVGDHD-1对新西兰白兔有致死性。将15日龄的新生健康仔猪分成3组,每组5头。第1组滴鼻接种滴度为107TCID50的病毒液2ml,第2组滴鼻接种滴度为106TCID50的病毒液2ml,第3组作为对照组滴鼻接种2ml无菌生理盐水。接种病毒液的第1组与第2组仔猪表现出高热、呼吸困难、神经症状等明显的伪狂犬病毒感染症状,至第10天全部发病死亡,且高滴度病毒攻毒组致死速度明显快于低滴度病毒攻毒组;对照组正常。将15日龄含抗PRV母源抗体的健康仔猪分3组,每组5头。第1组通过滴鼻接种滴度为107TCID50的病毒液2ml,第2组通过滴鼻接种滴度为106TCID50的病毒液2ml;第3组作对照组通过滴鼻接种2ml无菌生理盐水。接种病毒液的第1组与第2组仔猪均表现出高热、呼吸困难及神经症状等伪狂犬病毒感染症状,至第11天全部死亡;对照组正常。另选用8日龄新生健康仔猪分3组,每组5头。第1组免疫市售国产PRV弱毒活疫苗2ml,第2组免疫市售进口的PRV弱毒活疫苗2ml,对照组接种等量无菌生理盐水;21天后再分别对第1组和第2组进行滴鼻接种滴度为107TCID50的病毒液2ml,对照组滴鼻接种2ml无菌生理盐水。结果显示:第1组在攻毒后猪出现高热、严重呼吸困难、共济失调、倒地后四肢划动症状,第7天全部死亡;第2组表现出体温升高、精神沉郁、昏睡、扎堆、咳嗽等较为缓和症状,第10天全部死亡;对照组正常。猪的毒力试验结果表明PRVGDHD-1对新生仔猪有致死性,母源抗体、选用的市售弱毒疫苗不能抵抗PRVGDHD-1的感染,证实PRVGDHD-1毒力强。上述研究结果为选择合适的疫苗株,研制针对新流行毒株的疫苗奠定基础。
【图文】：

模式图,病毒结构,模式图

中的水痘病毒属（Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）。完整的病毒粒子呈圆形或球形，拥有囊膜，直径约逡逑为１５０ｎｍ￣１８０ｍｎ，该病毒是典型的双链ＤＮＡ病毒，成熟的病毒粒子结构分为核忘、逡逑核衣壳、包膜，其中包膜又分为皮层和囊膜，如图１．１所示Ｗ。该病毒的核忘由线状逡逑双股ＤＮＡ与一些蛋白组成核衣壳由壳粒按照一定的排列顺序组成，一般呈正十逡逑二面体，，直径约为１０５ｎｍ？ｌｌＯｎｍ；核衣壳外覆盖的为厚薄不均的皮层结构，皮层结构逡逑在负染条件下一般呈现为纤维样状态，在Ｗ超薄切片观察时是无定形的物质；最外层逡逑的结构为脂质双层的囊膜，囊膜上面分布有突起。逡逑图１．１邋ＰＲＶ病毒结构模式图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋化ｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｉｄｅｏｇｒａｐｈ邋ｏｆ邋Ｐ民Ｖ邋ｖｉｒｉｏｎ邋［叫逡逑２伪狂犬病毒基因组特征逡逑由于在疮疹病毒科的病毒基因组里有一种基因共线性的排列方式，而且这种方式逡逑２逡逑

猪伪狂犬病毒GDHD-1株的分离鉴定与致病性研究

图２．７邋ＰＲＶ邋ＧＤＨＤ－１株班基因的恅传进化关系树逡逑?
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651

【参考文献】