瘦素对ATDC5细胞增殖分化的影响

发布时间：2019-10-17 01:43

【摘要】：为了研究瘦素对ATDC5细胞增殖分化的影响,本试验以ATDC5细胞作为软骨细胞模型,分别采用0 ng/m L(对照组)、10 ng/m L、100 ng/mL三种不同浓度的瘦素刺激ATDC5细胞。在ATDC5细胞培养14 d时,进行阿利新蓝蛋白聚糖染色,采用RT-PCR法检测Ⅱ型胶原、Sox9、Aggrecan基因的相对表达量,用Western blot法检测Sox9及Aggrecan的蛋白相对表达量;21 d时,进行茜红S钙化结节染色,采用RT-PCR法检测Ⅹ型胶原mRNA的表达量,Western blot法检测Ⅹ型胶原蛋白的相对表达量,在此之后检测瘦素对碱性磷酸酶活性的影响。本试验结果显示:阿利新蓝染色后,各组之间并无肉眼可见的差异,不足以证明瘦素对蛋白聚糖分泌量的影响;茜红钙化结节染色后,通过检查结节数量的多少发现,随着瘦素浓度增加钙化结节数量减少。通过基因与蛋白水平的进一步检测发现,Sox9 m RNA表达量随着瘦素浓度的增加呈下降趋势,实验组与对照组之间相比差异极显著(P0.01),两实验组间相比差异极显著(P0.01);其蛋白的相对表达量在瘦素浓度为10 ng/m L和100 ng/m L时均呈上升趋势,与对照组相比差异极显著(P0.01);随着瘦素浓度增高,Ⅱ型胶原mRNA表达量在瘦素浓度为10 ng/m L时有所增加,与对照组相比差异显著(P0.05),瘦素浓度为100ng/m L时表达量下降。与对照组无差异(P0.05),与10 ng/m L组相比差异显著(P0.05);与对照组相比,随瘦素浓度增加,Aggrecan m RNA表达量呈下降趋势,瘦素浓度为10 ng/m L时,基因表达量与对照组相比差异显著(P0.05),瘦素浓度为100 ng/m L时,mRNA的表达量与对照组相比,差异极显著(P0.01),两个加瘦素的实验组相比,差异极显著(P0.01),其蛋白表达量与基因的表达趋势一致,也随瘦素浓度的增加而下降,100 ng/m L组与对照组相比差异显著(P0.05),其它均无差异(P0.05),以上结果表明,瘦素浓度的增加会抑制Sox9基因的表达,但其蛋白的表达量反而增加。在一定范围内,瘦素浓度的增加会促进Ⅱ型胶原,但瘦素浓度超过一定范围,Ⅱ型胶原的分泌量便会下降;较高浓度的瘦素会抑制Aggrecan基因以及蛋白的表达;Sox9可以增强Ⅱ型胶原与Aggrecan启动子的活性,而瘦素下调了Sox9的基因表达量,因此Ⅱ型胶原与Aggrecan的表达量下降。与对照组相比,Ⅹ型胶原mRNA表达量随着瘦素浓度的增加显著上升,瘦素浓度为10 ng/m L时,与对照组之间无差异(P0.05),瘦素浓度为100 ng/m L时,其mRNA的相对表达量明显增加,与对照相比差异极显著(P0.01),与10 ng/m L组相比差异极显著(P0.01);Ⅹ型胶原蛋白的表达量在瘦素浓度为10 ng/m L和100 ng/m L时均显著上升,且两实验组组之间差异极显著(P0.01),且两实验组与对照组相比差异极显著(P0.01);碱性磷酸酶活性检测结果表现为:ALP活性随着瘦素浓度的增加而增强。软骨细胞分化后期会发生肥大,分泌Ⅹ型胶原,瘦素浓度增加会促进Ⅹ型胶原的分泌,抑制钙化,碱性磷酸酶活性增强。Ⅱ型胶原、Sox9、Aggrecan、Ⅹ型胶原以及碱性磷酸酶是细胞增殖分化的不同阶段所分泌的不同标志性因子,存在于细胞外基质中,这些因子的变化会反映出整个骨关节的状态。本试验的检测结果表明,一定浓度的瘦素会抑制ATDC5细胞的增殖分化。正常的软骨组织组织中瘦素含量很低,本实验供给的外源性瘦素,相当于较高浓度的瘦素水平。因此,本试验认为瘦素浓度的增加会在一定程度上抑制ATDC5细胞的增殖分化,且浓度越高作用越强,瘦素水平较高,细胞外基质结构破坏,细胞长期处于肥大阶段,钙化作用受阻,导致骨形成障碍。
【图文】：

P<0.05，**表示差异极5，##表示 100 ng/mL 与 10 ta compared with control ly significant, P<0.01; # repextremely significant differenc图 3-1 CCK8 细胞活性3-1 Detection of CCK8 ce测结果 RNA测定发现，OD260取的样品总 RNA 浓度可发现，，清晰可见 28 S、1解。

图 3-3 阿利新蓝染色结果Fig.3-3 The results of Alcian blue staining如图 3-4 所示，随着瘦素浓度的增加，钙化结节数量减少，说明随着瘦素浓度的增加，钙化作用减弱。图 3-4 茜红染色结果Fig.3-4 The results of alizarin red staining3.4 瘦素对 ALP 活性的影响如表 3-5 所示，加入瘦素后，与对照组相比较，在瘦素浓度为 10 ng/mL 时，碱性磷酸活性上升，差异显著（P<0.05）；瘦素浓度为 100 ng/mL 时，与对照组相比差异极显著（P<0.01
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.2

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 冯晓雷;吴俊毅;;碱性磷酸酶在骨肿瘤诊断中的价值[J];中国肿瘤临床与康复;2016年08期

2 冯其帅;高丽娜;崔元璐;;ATDC5:一株反映软骨形成完整过程的细胞系[J];天津中医药大学学报;2015年06期

3 杨晓宁;张辰雨;王炳蔚;祝世功;郑瑞茂;;瘦素信号与瘦素抵抗机制研究进展[J];生理科学进展;2015年05期

4 韩沐;颜廷鑫;王栋梁;;瘦素参与骨代谢调节的进展及展望[J];现代生物医学进展;2015年14期

5 宁志刚;王富友;崔运利;熊娟;杨柳;;可溶性猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的提取与鉴定[J];重庆医学;2011年10期

6 黄哲;沈名扬;王俊江;丛进春;陈春生;;血清瘦素与结直肠癌相关癌基因表达的相关性[J];世界华人消化杂志;2010年14期

7 关小红;冯云审;;瘦素与人类生殖关系的研究进展[J];中国实用妇科与产科杂志;2010年03期

8 李超;曹永平;关振鹏;黄德勇;葛子钢;;蛋白聚糖酶和骨关节炎[J];北京大学学报(医学版);2009年05期

9 胡建忠;王子朴;;瘦素(Leptin)的生理作用机制及长期运动对其水平的影响[J];上海体育学院学报;2008年05期

10 白庆阳;谷俊朝;卢晓梅;俞巍;刘建中;;乳腺癌组织瘦素和瘦素受体表达及其临床意义的研究[J];中华肿瘤防治杂志;2008年13期

相关博士学位论文 前1条

1 陈微微;NELL-1蛋白对小鼠ATDC5细胞软骨分化的调控机制和对人血管周细胞成骨分化作用的研究[D];浙江大学;2011年

相关硕士学位论文 前3条

1 徐巨梁;骨关节炎患者脂肪细胞因子的表达及其与骨密度的相关性研究[D];苏州大学;2014年

2 谢晔;Sox9在大鼠骨关节炎软骨中的表达及Wnt/β-catenin信号通路干预对其的影响[D];苏州大学;2013年

3 曲源;骨碱性磷酸酶在RA与OA的血清及滑液中的对照研究[D];辽宁中医药大学;2010年

本文编号：2550298