Hippo-YAP1通路参与调控湖羊肌肉生长、发育机理的研究

发布时间：2019-10-17 08:14

【摘要】：本实验以湖羊为研究对象。首先,利用q-PCR技术对湖羊Smads基因在出生后不同生长阶段、不同性别、不同骨骼肌(背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌)的相对表达进行了分析。其次,利用胶原酶和胰酶联合消化法,成功从湖羊肌肉组织中分离出了骨骼肌卫星细胞,并采用差速贴壁法对其进行了纯化,所得细胞生长状态良好,纯度较高,低血清诱导后可以分化成肌管。最后,利用脂质体转染法,在湖羊肌卫星细胞中对YAP1进行了过表达后相关研究。初步探讨Hippo-YAP1通路参与调控湖羊肌肉生长、发育的机理。本研究获得了以下结果：1. Smads基因在湖羊背最长肌中的表达量均低于其他肌肉组织；Smad2、Smad3、Smad4基因均在二日龄的表达量最高,Smad7基因在六月龄时表达量最高；Smad2、Smad3、Smad4基因在二日龄公羊中的表达量高于母羊,六月龄则低于母羊；2.在四种不同肌肉组织中,Smad2与Smad3, Smad3与Smad4均存在极显著正相关(P0.01),体现了其共同对TGF-β/smad信号通路的抑制作用。YAP1与MSTN间均存在极显著正相关(P0.01),进一步说明了YAP1可能通过参与调控TGF-β/smad通路活性而参与肌肉的增殖和分化过程；3.成功从湖羊肌肉组织中分离出了肌卫星细胞。并采用差速贴壁法对其进行了纯化。所得细胞生长状态良好,纯度较高,低血清诱导后可以分化成肌管。Q-PCR结果表明在湖羊肌卫星细胞大量分化为肌管的过程中,YAP1与MyoG基因的表达量表现出明显增加的趋势,MSTN则降低；4.过表达YAP1-Ser42Ala基因能够促进湖羊肌卫星细胞的增殖,但在48h内未能达到显著差异水平。对YAP1基因过表后,发现MSTN表达量降低,而MyoG、mad3、Smad4、 Smad7、Lats1基因表达量则增加,其中Smad3基因表达量差异极显著(P0.01),其它差异均不显著。
【图文】：

绵羊,骨骼肌,湖羊,肌卫星细胞

采用连续２－３代差速贴壁纯化湖羊骨骼肌卫星细胞后，进行细胞化学间接免疫焚光鉴逡逑定显示，细胞Ｐａｘ－７阳性率为（９３．６±２．３）邋％，细胞ＭｙｏＤ阳性率为（９４．４＋１．５）邋％，结逡逑果表明上述方法获得的肌卫星细胞达到％．５％＾上（图３－２）。逡逑桯曲逡逑隹逡逑姦灥屼猫Ｉ国WＩ逡逑图３－２绵羊骨骼肌：Ｒ吊细胞鉴定（１００Ｘ）逡逑Ｆｉｇ邋３－２．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｈｅｅｐ邋ｓｋｅｌｅｔａｌ邋ｍｕｓｃｌｅ邋ｓａｔｅｌｌｉ化邋ｃｅｌｌｓ邋（１０0ｘ）逡逑Ａ：邋Ｐａｘ－７；邋Ｂ：邋ＭｙｏＤ．逡逑２．３湖羊肌卫星细胞成肌诱导分化逡逑在用２％ＨＳ诱导分化过程中，湖羊肌卫星细胞在０－ｌｄ时细胞增殖很快，，形态上无明显逡逑变化；继续分化培养时细胞开始延伸变长，２－３ｄ可见少数细胞开始融合形成短小的肌管；逡逑

趋势图,量变,基因表达,趋势

逦邋３７逡逑２．５成肌分化过程肌相关ｍＲＮＡ分子表达情况逡逑由图３－５可Ｗ看出，随着诱导分化时间的延长，ＹＡＰ１基因的表达量逐渐增加，第一天逡逑与第Ｈ天的表达量存在显著性差异（户＜0．0５），与第五天存在着极显著差异（尸＜0．0１）；而逡逑ＭＳＴＮ基因则随着诱导时间的推移有递减的趋势，第一天与第＝天和第五天均表达量存在逡逑极显著关系（ｉ＾Ｏ．Ｏｌ），第Ｈ天与第五天差异不显著（Ｐ＞0．0５）；邋ＭｙｏＧ基因则先增加后降逡逑低，第Ｈ天和第五天较第一天表达量显著增加存在显著或极显著差异（ｆ＜0．0５）。逡逑５逦１逦Ａａ逦＂ｄ逡逑Ａ邋４．５逦－逦１邋ｇ％逡逑＜逦４逦－逦自口邋３ｄ逡逑ｉ＇－３：逡逑Ｉ邋－逦Ａ裤逦W逡逑Ｓ邋＇邋Ａａｊｙ逦Ａａ逦Ｂｅｌ逡逑馨。ｊ；ＪＩ逦ｆａｙｒｉ逡逑ｕ邋？逦Ｉ逦—－逦Ｉ逦Ｉ逡逑ＹＡＰＩ逦ＭＳＴＮ逦ＭｙｏＧ逡逑基因逡逑图３－５基因表达量变化趋势逡逑Ｆｉｇ邋３－５．Ｔｈｅ邋ｔｒｅｎｄ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｈｒｅｅ邋ｇｅｎｅｓ逡逑注：Ａ邋（ａ）、Ｂ邋（ｂ）、Ｃ邋（ｃ）系列的字母表示的是诱导肌卫星细胞不同天数间的多重比较结果；相逡逑同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著，不同大写字母表示差异极显著。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ａ，邋Ｂ，邋Ｃ，邋ａ，邋ｂ，邋Ｃ邋ｓｈｏｗ邋ｔｈｅ邋化５山ｔｓ邋ｏｆ邋ｍｕｌｔｉｐｌｅ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄａｙｓ．邋Ｔｈｅ邋ｓａｍｅ邋ｌｅｔｔｅｒｓ邋ａｒｅ邋ｎｏ逡逑ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅ化ｎｔ邋（b6＞０．０５）
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826

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