犬细小病毒性肠炎两种快速检测方法的建立与应用

发布时间：2019-10-21 17:41

【摘要】：犬细小病毒性肠炎（Canine parvovirus enteritis）是由犬细小病毒（Canineparvovirus, CPV）引起的在犬科动物中广泛传播和流行的一种高度接触性传染病，患病犬主要表现为剧烈呕吐、腹泻、出血性肠炎和非化脓性心肌炎，是危害我国养犬业和宠物业的重要疫病之一。目前，该病没有特效的治疗方法，主要依靠接种疫苗进行免疫预防。因此，快速检测犬细小病毒的抗原和抗体对于犬细小病毒性肠炎的预防、诊断、治疗和流行病学分析具有重要意义。本研究从以下三部分针对犬细小病毒抗原和抗体检测开展了研究，建立了犬细小病毒性肠炎的两种快速检测方法：检测犬细小病毒抗体的间接ELISA方法和检测犬细小病毒抗原的免疫胶体金试纸条。 1犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立本部分研究采用饱和硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心法对利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达的犬细小病毒病毒样颗粒（CPV-VLPs）进行纯化，，并以纯化后的CPV-VLPs作为包被抗原建立了犬细小病毒抗体间接ELISA检测方法。结果表明：纯化后CPV-VLPs纯度达90%以上，经SDS-PAGE和Westernblotting鉴定纯化后CPV-VLPs在约70KD处有单一条带，能和CPV阳性血清发生特异性反应。经过优化的间接ELISA工作条件为：抗原包被浓度为5ug/mL，4℃包被过夜；1%BSA37℃封闭2h；待检血清1:40稀释，37℃孵育1.5h；酶标二抗1:20,000稀释，37℃孵育1h；TMB室温避光显色30min，0.5M H2SO4终止显色，在450nm波长处测定OD值。该ELISA抗体检测方法的特点是：1）特异性强：可特异性检测CPV阳性血清，而不与CDV、RABV、ICHV、CCV阳性血清发生非特异性反应；2）敏感性良好：当标准阳性血清1:640稀释后仍能检测出阳性；3）重复性好：批内和批间重复试验变异系数均小于10%；4）符合率高：使用该方法和血凝抑制试验（HI）分别对42份临床血清样本进行抗体检测，二者的符合率达90.48%。 2犬细小病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定本部分研究采用PEG沉淀、蔗糖密度梯度离心法纯化F81细胞培养的CPV，并以此制备免疫原免疫6-8周龄Balb/c小鼠，经过3次免疫后血清ELISA效价达到1:105，加强免疫后3天采用PEG诱导融合法进行免疫小鼠脾淋巴细胞和SP2/0骨髓瘤细胞的融合。使用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，利用有限稀释法克隆筛选阳性杂交瘤细胞，经过3次克隆获得3株能够稳定分泌犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A3、6B10、7F12。3株杂交瘤细胞经间接ELISA方法检测细胞上清抗体效价分别为1:103、1:103、1:103，小鼠腹水抗体效价分别为1:106、1:105、1:107；经HI试验检测细胞上清抗体效价分别为28、28、28，小鼠腹水抗体效价分别为215、214、215；经亚类鉴定1A3为IgG2a亚型，6B10为IgG3亚型，7F12为IgG2b亚型。3株杂交瘤细胞经连续传代和冻存、复苏后，其细胞上清ELISA效价不变。以上数据表明：筛选获得的3株单克隆抗体特异性高，不仅能和犬细小病毒发生结合反应，且具有特异性的血凝抑制作用。 3犬细小病毒免疫胶体金检测试纸条的制备与应用本部分研究采用饱和硫酸铵沉淀、Protein G蛋白亲和层析柱纯化1A3、7F12两株单抗，纯化后蛋白浓度分别为3.21mg/mL和5.421mg/mL。采用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金，利用纯化后的1A3单抗标记胶体金，以纯化后的7F12单抗作为检测线，羊抗鼠IgG作为质控线，根据双抗体夹心原理制备犬细小病毒免疫胶体金检测试纸条。该试纸条能特异性的检测出细小病毒属的CPV、MEV、FPV，而不与CDV、RABV、ICHV、CCV发生非特异性反应；敏感性为80个HA单位/mL；分别采用不同方法对90份临床粪便样品进行检测，与PCR试验相比，本研究制备的CPV免疫胶体金检测试纸条的敏感性和特异性分别是94.4%和100%，总符合率是95.6%；与PCR相比，韩国Bioindist公司CPV免疫胶体金检测试纸条的敏感性和特异性分别是97.3%和88.9%，总符合率是95.6%。以上结果表明：所制备的细小病毒免疫胶体金检测试纸条特异性和敏感性好，操作简便、快速，适用于临床样品的大量、快速检测。
【图文】：

细胞,血清,抗原,血凝抑制试验

次纯化的 CPV-VLPs 作为包被抗原，在相同时间对 5 份阳性血清和 1 份阴性血清进行检测，每批抗原同一份血清重复 2 次，统计学分析不同批次抗原对同一血清的检测结果，计算批间变异系数。2.3.4 临床样品检测采用本研究建立的间接 ELISA 方法检测从吉林、辽宁等地采集的 42 份临床血清样本，同时进行血凝抑制试验做对比，计算二者的符合率。3 结果3.1 CPV-VLPs 制备及纯化3.1.1 CPV-VLPs 的培养结果在显微镜下观察，正常的昆虫细胞呈圆形、透亮、紧密排列、紧贴平皿底部生长，接种表达犬细小病毒 VP2 蛋白的重组杆状病毒后，可见细胞肿胀，体积明显增大，贴壁不牢，出现大量因脱落而悬浮的细胞，。

电镜图,电镜,杂蛋白,条带

图 1.2 电镜下观察纯化后 CPV-VLPsg.1.2 The CPV-VLPs detected by electron mi-VLPs 的 SDS-PAGE 分析结果E 对纯化前后的 CPV-VLPs 进行比较，结果无杂蛋白存在，仅有单一条带，大约在 70KD。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.3

【参考文献】