1型和3型鸭甲肝病毒在临床死亡雏鸭体内分布的研究

发布时间：2019-10-22 13:46

【摘要】：鸭甲肝病毒(Duck Hepatitis A Virus,DHAV)引起的雏鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)呈世界性分布,雏鸭发病死亡后呈现明显的角弓反张症状,病理上以肝脏肿大出血为主要特征,具有高度传染性和接触性。该病发病迅速,致死率高。DHAV可分为三个基因型:DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。在我国大陆,鸭病毒性肝炎主要由DHAV-1和DHAV-3引起,两种病毒感染雏鸭后的临床症状和病理变化极为相似,临床诊断难以对其进行区分,且生产中存在二者混合感染现象,这为该病的防治增添了困难。本研究建立了可以同时检测DHAV-1与DHAV-3的双重荧光定量PCR方法,并对DHAV-1和DHAV-3在山东省内的流行病学及临床上病毒在雏鸭体内的分布进行了研究。本研究主要包括两部分:1.检测DHAV-1与DHAV-3的双重荧光定量PCR方法的建立根据DHAV-1和DHAV-3基因组序列比对结果,分别于两种病毒序列保守区设计合成了两对能特异性扩增片段的引物和两条TaqManTM探针,探针分别以CY5/BHQ-2和FAM/TAMRA双标记,建立了能够同时检测DHAV-1和DHAV-3的双重荧光定量PCR诊断方法。经条件优化后,检测DHAV-1的标准曲线为YDHAV-1=-3.2850x+40.812,相关系数为0.998,PCR循环效率为101.5%,在6.7×103~6.7×107copies/μL内有良好的线性关系,检测DHAV-1病毒cDNA模板的灵敏度为14copies/PCR,组内变异系数为0.28%~1.24%,组间变异系数为0.29%~0.79%;检测DHAV-3方法中标准曲线为YDHAV-3=-3.2791x+39.216,相关系数为0.999,PCR循环效率为101.8%,在1.1×102~1.1×107copies/μL内有良好的线性关系,检测DHAV-3病毒cDNA模板的灵敏度为22copies/PCR,与单重荧光定量PCR一致,组内变异系数为0.28%~1.81%,组间变异系数为0.22%~0.72%;特异性试验结果显示,同一体系内两对特异性引物和探针只能从对应的阳性样本中扩增出特异片段,DHAV-1和DHAV-3相互之间无交叉扩增反应,对其他七种禽类常见病原及健康鸭肝组织也无扩增,表明其特异性良好。分别应用所建立的双重荧光定量PCR方法和常规RT-PCR方法对30份人工感染DHAV-1和DHAV-3雏鸭肝脏以及200份临床疑似患DVH病鸭的肝脏进行检测,结果显示:两种方法对人工感染DHAV-1和DHAV-3雏鸭的检测阳性率均为100%。用荧光定量PCR方法对200份疑似患鸭病毒性肝炎病鸭的肝脏的临床样本进行检测,DHAVs的检出率为97.5%,DHAV-1的阳性检出率为29%,DHAV-3的阳性检测率为56.5%,混合感染阳性率为12%。送检雏鸭共31群,4群检出混合感染,13群DHAV-1阳性感染,13群DHAV-3阳性感染。研究结果表明建立的双重荧光定量PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于快速鉴别诊断DHAV-1和DHAV-3以及对感染雏鸭体内病毒的实时定量检测。2.DHAV-1和DHAV-3在临床中雏鸭体内的分布规律研究对临床送检的DHAV阳性病死雏鸭进行各脏器的采集,包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、脑和胰腺,应用建立的双重荧光定量PCR法定量检测DHAV-1和DHAV-3在雏鸭体内病毒分布情况。结果发现:被检组织器官中均可检测到DHAV,但不同组织中DHAV含量差异较大,表明DHAV在雏鸭体内有广泛的组织嗜性。剖检可见雏鸭的肝脏、脾脏和肾脏眼观病变最为明显,大多呈现肿大和出血、坏死,荧光定量PCR检测结果显示,DHAV-1和DHAV-3含量最高的器官依次为肝脏和脾脏,其中DHAV-1病毒含量依次高达1012.32和1011.23copies/g,DHAV-3病毒含量依次高达1012.07、和1011.63copies/g。剖检胸腺、胰脏有出血现象,法氏囊肿大,部分脑组织出现水肿和液化灶。胸腺、胰脏、心脏、脑和法氏囊也可检测到DHAV,但含量略低,以上结果显示雏鸭体内脏器病理变化的严重程度与病毒含量呈正相关关系,且肝脏和脾脏是DHAV增殖的理想靶器官。通过独立样本T检验分析,结果显示,雏鸭混合感染DHAVs死亡后与单独感染后同一器官中的病毒含量没有明显差异,表明混合感染对病毒在雏鸭体内的后期增殖没有影响。送检雏鸭的死亡日龄集中在5~14日龄,且经Spearman相关性分析,雏鸭体内的病毒含量与雏鸭日龄没有相关性,该结果为鸭病毒性肝炎的致病机理奠定了理论基础。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.32

【参考文献】