嗜酸乳杆菌对猪小肠上皮细胞IPEC-J2氧化应激损伤的修复作用及其机制研究

发布时间：2019-10-23 10:01

【摘要】：本试验旨在应用细胞系氧化应激模型、蛋白免疫印迹(Western Blot)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)等技术手段,从细胞和分子水平探究嗜酸乳杆菌与仔猪小肠上皮细胞氧化应激之间的内在关系及阐明NF-κB信号通路在仔猪小肠上皮细胞氧化应激过程中的介导作用。研究结果将为揭示嗜酸乳杆菌调控仔猪小肠上皮细胞氧化应激的作用机制提供理论依据,并为嗜酸乳杆菌在仔猪饲料中的科学应用提供理论依据。所得出在结果如下:(1)细胞存活率随着H_2O_2浓度的增加而降低,H_2O_2浓度处于1.2~1.8 mM时,细胞的存活率虽然有所下降但差异不显著(P0.05),此时其存活率为60%左右。细胞上清液SOD、GSH-Px、CAT活力随着H_2O_2作用浓度升高,SOD、GSH-Px、CAT活性显著下降(P0.05),MDA差异不显著。细胞内MDA含量随着H_2O_2浓度的升高而显著降低(P0.05),SOD、GSH-Px、CAT差异不显著。以上结果提示:1.2 mM的H_2O_2能造成IPEC-J2细胞的氧化应激,可以作为构建体外细胞氧化应激模型的终浓度。(2)正常条件下细胞活力随着嗜酸乳杆菌浓度的增加而上升。氧化应激状态下IPEC-J2细胞活力也随着嗜酸乳杆菌浓度的增加而逐渐上升,当菌浓度大于1.0×108CFU·m L-1时,细胞的存活率超过对照组;当嗜酸乳杆菌浓度大于1.0×109 CFU·m L-1时,细胞存活力差异不显著(P0.05)。细胞上清液中各组中SOD、GSH-Px活力存在显著差异,而CAT活力差异不显著。细胞内MDA含量存在显著差异。其中,随着嗜酸乳杆菌作用浓度升高,SOD、GSH-Px活性显著增加(P0.05),MDA含量显著降低(P0.05)。添加了嗜酸乳杆菌组中,细胞浆内ZO-1、Occludin、Claudin蛋白相对表达量低于对照组和过氧化氢组(P0.05)。过氧化氢组高于对照组,但差异不显著。(3)过氧化氢能够显著提高细胞内磷酸化IκBα。嗜酸乳杆菌预处理后,P-IκBα蛋白显著下降。Bay抑制剂则能逆转这种下降。嗜酸乳杆菌能显著提高细胞内磷酸化NF-κB蛋白的表达量(P0.05)。嗜酸乳杆菌可以显著地提高细胞内TLR2蛋白表达(P0.05)。三种抑制剂均能显著地抑制细胞内TLR2蛋白的表达(P0.05)。嗜酸乳杆菌能够显著提高细胞内IL-1β蛋白的表达(P0.05)。PDTC、Bay、小白菊内酯预处理均能抑制这种高表达(P0.05)。与对照组相比,过氧化氢和嗜酸乳杆菌都能提高细胞内Myd88 mRNA的表达(P0.05)。与嗜酸乳杆菌组相比,Bay抑制剂预处理后能下调Myd88 mRNA的表达,PDTC预处理组反而显著增强了该基因的表达,小白菊内酯差异性不显著。与对照组相比,其余各组TLR2、TLR3mRNA表达显著下降,其余各组间差异性不显著。与对照组、过氧化氢组和嗜酸乳杆菌组相比,PDTC和小白菊内酯组均能显著下调TLR4 mRNA的表达。与对照组相比,过氧化氢组、bay抑制剂组和小白菊内酯组均显著下调p65 mRNA的表达量,而嗜酸乳杆菌组和嗜酸乳杆菌预处理组显著增强p65 mRNA的表达(P0.05)。与对照组相比,过氧化氢组、嗜酸乳杆菌组以及bay预处理组均显著提高IKKβmRNA相对表达量(P0.05)。其余各组与对照组相比,IκBαmRNA相对表达量显著下降。其余各组差异不显著。过氧化氢能够显著提高肿瘤坏死因子的表达,嗜酸乳杆菌预处理能显著下调肿瘤坏死因子的高表达(P0.05)。嗜酸乳杆菌显著提高IL-1β、IL-8 mRNA相对表达量(P0.05)。bay和小白菊内酯抑制剂能显著减缓这种高表达(P0.05)。综和以上结果,我们可以得出:1.2 mM的H_2O_2能造成IPEC-J2细胞的氧化应激,可以作为本试验构建体外细胞氧化应激模型的终浓度。嗜酸乳杆菌能够促进细胞的生长,增强细胞的抗氧化水平,降低胞浆内紧密连接蛋白的表达量。嗜酸乳杆菌预处理能显著下调TNF-α等细胞因子的高表达,减缓过氧化氢诱导IKK的表达,在一定程度上抑制NF-κB信号通路的发生。
【图文】：

图 2.1 H2O2对 IPEC-J2 细胞活力的影响Fig. 2.1 Effect of H2O2on cellular activity of IPEC-J2 cells2O2对 IPEC-J2 细胞上清液中 MDA 含量及抗氧化水平的影由表 2.1 所知，细胞上清液中各组中 SOD、GSH-Px、CAT 活力存在显著DA 含量差异不显著。其中，随着 H2O2作用浓度升高，SOD、GSH-Px、著下降（P<0.05）。当 H2O2作用浓度为 1.2 mM，SOD 活力显著低于对照1.0 mM，且 1.4、1.6、1.8、2.0 mM 组与之差异不显著（P>0.05）。表 2.1 H2O2对 IPEC-J2 细胞上清液中 MDA 含量及抗氧化水平的影响able 2.1 effect of H2O2on MDA content and antioxidant activity in IPEC-J2 cell supern度 concentration/丙二醛MDA/（nmol/mg prot）超氧化物歧化酶SOD/（IU/ mg prot）谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px/（IU/ mg prot）（6.23±1.048 32.14±3.589a6.73±2.020a7.71±1.767 28.58±5.525a5.39±0.284ab6.58±0.511 21.90±1.756b5.28±0.315ab

目的蛋白电泳及 Western-blot具体试验步骤按实验要求进行。 数据统计处理仔猪上皮细胞活力以 MTT 法测出 OD 值计算，相关蛋白表达量以“样本蛋÷同一样本 GAPDH 灰度值”计算。采用 SPSS 17.0 软件对数据进行方差分析进行多重比较。P<0.05 为差异显著性判断标准。结果与分析 嗜酸乳杆菌对 IPEC-J2 细胞活力的影响由图 2.2 可知，，当嗜酸乳杆菌浓度小于 1.0×109CFU·mL-1时，随着嗜酸乳的增加，细胞活力随有增加但差异不显著（P>0.05）；当菌浓度大于 U·mL-1时，细胞的存活力显著高于对照组（P<0.05）；当嗜酸乳杆菌浓度大于U·mL-1时，细胞存活力差异不显著（P>0.05）。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S828

【参考文献】

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本文编号：2552060