PA-X蛋白在H5N1高致病性禽流感病毒小鼠致病性中的作用

发布时间：2019-10-25 11:08

【摘要】：A型流感病毒(Influenza A virus, IAV)可感染哺乳动物在内的多种宿主,对公共卫生安全造成了巨大的威胁。由于其基因组的多变性,IAV的致病性也因其基因亚型的多样性表现出很大的差异。除此之外,IAV基因组的单个基因片段能表达多个病毒蛋白,而这使得IAV的致病机理变得更加复杂。20世纪70年代,科学家们首次描绘了IAV的基因组,发现其基因组能表达10种病毒蛋白,并将它们分别命名为PB2、PB1、PA、HA、NP、 NA、M1、M2、NS1和NS2。2001年,科学家又发现了一个由PB1的替代开放阅读框所编码的辅助蛋白,并将其命名为PB1-F2。此后,另外6个病毒辅助蛋白PB1-N40、PA-X、 M42、NS3、PA-N155和PA-N182也相继被发现。PA-X是一个约29 kD的小蛋白,是IAV基因组片段3编码的。Jagger等人已经证实PA-X蛋白可以减弱1918 H1N1大流行流感病毒对小鼠的致病性,并能抑制宿主的先天性免疫应答,尤其是能够显著调节与炎症及凋亡相关的免疫应答。Desmet等人发现该蛋白与宿主细胞关闭和抑制宿主的抗病毒应答相关。Khaperskyy等人则从应激颗粒(stress granule, SG)的角度阐释了PA-X蛋白的作用,他们发现PA-X能抑制SG的形成。而最近高慧杰等人发现PA-X蛋白可以抑制2009 H1N1大流感病毒和H5N1禽流感病毒对小鼠的毒力。我们之前的研究也发现PA-X削弱了高致病性H5N1禽流感病毒对小鼠、麻鸭和SPF鸡的毒力,并且阐明了PA-X可能是通过抑制病毒的复制和宿主的免疫应答来减弱病毒对禽类的毒力。一、PA-X蛋白在H5N1高致病性禽流感病毒小鼠致病性中作用为了探索PA-X蛋白在H5N1禽流感病毒(Avian Influenza virus, AIV)对哺乳动物致病性中的作用,我们以一株H5N1高致病性禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/k0402/2010(CK10)作为母本病毒,通过反向遗传技术拯救了两株PA-X蛋白表达量不同程度降低的突变株CK-PAX3和CK-PAX5。我们首先利用Western Blotting证实了两株突变病毒CK-PAX3和CK-PAX5的PA-X蛋白表达量相对于母本病毒分别降低了53%和15%。之后在小鼠的致病性实验中,我们发现PA-X蛋白表达量降低之后,H5N1 AIV对BABL/c小鼠的致病性增强了,体现在突变株感染组的小鼠体重下降更快、程度更大,出现死亡的时间更早,而CK-PAX3和CK-PAX5感染组的半数致死剂量较母本病毒分别降低了7.5倍和3.5倍。该结果进一步验证了Jagger等的结论,说明PA-X可能在不同亚型的禽流感病毒都起着类似的作用。另外,为了探索PA-X蛋白潜在的作用机制,我们进一步比较了重组病毒感染的小鼠肺脏的病理组织学变化。结果显示,在感染后第1天,CK-PAX3组和CK-PAX5组的小鼠肺脏的病变严重程度都要高于r-CK10组。感染后第1天CK-PAX3感染组表现为严重的间质性肺炎和支气管肺炎,其病变严重程度打分为1.71土0.49,而r-CK10组仅表现为轻微的支气管肺炎,病变严重程度打分仅为1±0。二、PA-X减弱H5N1病毒小鼠致病力的机理探索我们进一步探索了PA-X减弱H5N1病毒对小鼠毒力的可能机制。由于之前的研究显示PA-X缺失株能引起更加严重的肺脏损伤,所以我们通过测定体外细胞的凋亡和坏死情况进一步验证了重组病毒在诱导体外细胞的损伤中是否存在差异。利用annexin V和PI对MDCK和A549细胞进行双染,我们发现降低PA-X的表达量能够显著提高细胞死亡的比例。为了进一步探索重组病毒引起肺脏不同程度病理学变化的可能原因,我们又比较了重组病毒在体内、体外的复制能力。结果显示,在哺乳动物细胞(包括A549, RAW和Vero)内,CK-PAX3的复制能力要显著强于r-CK10。而小鼠脏器病毒滴度结果显示PA-X蛋白表达量降低使突变株在小鼠体内都具有相当的复制优势,表现在感染后第1天CK-PAX3和CK-PAX5感染组小鼠肺脏内病毒滴度显著高于r-CK10组、感染第3天CK-PAX3感染组小鼠脾脏内病毒滴度显著高于r-CK10组,而且突变株感染的小鼠脏器内能检测到病毒的小鼠数量多于母本病毒感染小鼠。然后,我们通过比较PA-X能否影响PA蛋白的核聚集能力来探索PA-X抑制病毒复制的可能原因。结果显示,降低PA-X的表达量能够显著增强PA的核聚集。另外,通过体外重构RNP实验,我们发现PA-X蛋白表达量降低之后,突变株的聚合酶活性要极显著高于母本病毒。我们推测这可能是突变株复制能力增强的主要原因。为了进一步探索重组病毒引起肺脏损伤差异的机制,我们通过测定小鼠肺脏中细胞因子的表达水平评价了PA-X在诱导宿主炎症反应中的作用。总体来说,与r-CK10相比,CK-PAX3诱导了更为强烈的细胞因子应答。在感染第1天, CK-PAX3诱导的CCL-3、CCL-4、CCL-5、CXCL-9、 CXCL-10、IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α等细胞因子的表达显著高于r-CK10；而CK-PAX5也诱导了更为强烈的CCL-4、CCL-5、CXCL-9、IFN-β和IL-6等细胞因子的表达。这些结果显示重组病毒的致病性差异以及不同程度的肺脏损伤很可能与宿主感染早期细胞因子的表达水平相关。本研究证实了PA-X蛋白能够减弱H5N1高致病性禽流感病毒对小鼠的毒力。而降低PA-X的表达能加快PA蛋白向核内聚集、增强病毒的体内外复制能力、加速细胞死亡、诱导宿主更为强烈的炎症应答。而这些可能都是突变株对小鼠致病性增强的原因。总之,本研究证明了PA-X是一种重要的毒力相关因子,为禽流感病毒的致病机制的研究提供了新的思路。
【图文】：

重组病毒

图３－１重组病毒在小鼠体内的复制能力逡逑Ｆｉｇ邋３－１邋Ｖｉｒａｌ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｉｎｆｅｃ化ｄ－ｍｉｃｅ．邋Ｇｒｏｕｐｓ邋ｏｆ邋ｎｉｎｅ邋６－ｗｅｅｋ＿－ｏｌｄ邋ｆｅｍａｌｅ邋ＢＡＢＬ／ｃ邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｔｉ＊ａｎａｓａｌｌｙ逡逑ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋１０５邋０ｅＩＤ５０邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｖｉｒｕｓｅｓ．邋Ｏｎ邋ｄａｙ邋１，邋２邋ａｎｄ邋３邋ｐ．ｉ．，，邋ｔｈｒｅｅ邋ｍｉｃｅ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋ｗｅｒｅ逡逑ｅｕｔｈａｎｉｚｅｄ邋ｔｏ邋ｃｏｌｌｅｃｔ邋ｏｒｇａｎｓ邋ｆｏｒ邋ｖｉｒｕｓ邋ｔｉｔｒａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｅｇｇｓ．邋Ｖｉｒａｌ邋ｌｏａｄｓ邋ａｒｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ邋±邋ＳＤ．邋Ｓｉｇｎｉｆｃａｎｔ逡逑－－

重组病毒

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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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