一株鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

发布时间：2019-11-03 07:04

【摘要】：近年来,江苏地区许多鹅养殖场陆续发现一种感染雏鹅为主的以出血性坏死性肝炎为特征的病毒性传染病。我们以发病鹅场采集患病鹅的实质性器官为病料,通过接种SPF鸡胚进行病毒的分离,并结合临床症状和病理变化,通过PCR、RT-PCR等分子生物学技术对病毒进行鉴定,确定为鹅呼肠孤病毒。暂时将本分离株命名为GRV JS2012。为了确定该病毒的分类学地位,我们通过有机溶剂敏感试验,温度敏感试验,血凝试验等证明该病毒为RNA病毒、不具有鸡血红细胞凝集特性,病毒对酸及氯仿不敏感,对胰蛋白酶敏感,对热有一定的抵抗力。然后将病毒液进行氯仿抽提、超高速差速离心及蔗糖密度梯度处理来纯化病毒,经磷酸钨负染色进行电镜观察,结果发现该病毒颗粒无囊膜、近似球形、直径约为80nm,具有双层衣壳结构,每层均为20面体对称,具有典型的呼肠孤病毒属特性。我们将病毒液通过绒毛尿囊膜接种9-11日龄的SPF鸡胚,连续观察2-6天,收集死亡鸡胚尿囊液及尿囊膜,依次接种至第3代。用第3代的尿囊液、胚体及绒毛尿囊膜测定ELD50。结果测得尿囊液的ELD50为10-5.633/0.2mL,胚体及绒毛尿囊膜对鸡胚的ELD50为10-583/0.2mL,表明胚体与绒毛尿囊膜的含毒量高于尿囊液。并将传代后的病毒尿囊液用于鸡胚成纤维细胞适应性试验,在原代鸡胚成纤维细胞上盲传5代,测定其TCID50,结果表明该毒株病毒对CEF的TCID50为10-5·75/0.1mL。此外,动物致病性试验表明,本分离株可以致死1日龄雏鹅,死亡率为100%,而对于青年鹅及中年鹅不致病。然后,我们依据NCBI已经发表的鹅呼肠孤病毒的基因序列,设计了3段引物。采用RT-PCR方法扩增得到3段目的片段,并对其序列进行测定分析,结果表明与已经发表的鸭呼肠孤病毒和鹅呼肠孤病毒亲缘性较近,通过单个基因的系统进化树分析显示,本分离株与参考株03G株、J18株同源性高达80%-90%,与标准株S1133同源性较低。由此可知,本分离株应该归属于禽正呼肠孤病毒属不同于鸡呼肠孤病毒分支的水禽呼肠孤病毒分支。最后,为了进一步了解本分离株与ARV、DRV及GRV之间的进化关系,我们对其进行全基因组序列分析。根据已发表的基因序列设计了13对引物,采用RT-PCR方法扩增得到目的片段,送至测序,对测序结果进行整理,分析其开放阅读框的大小及数目,并与呼肠孤病毒属的其他成员对比,绘制成基因进化树。结果表明GRV JS2012株病毒全长23,418bp,可分为大小不同的10个片段,组成病毒的10个片段大小如下：S1,1568bp； S2,1326bp；S3,1202bp；S4,1191bp；M1,2283bp；M2,2158bp；M3,1996bp；L1, 3958bp；L2,3829bp；L3,3907bp.与ARV其他毒株不同的是,GRV JS2012的σC蛋白由S1基因编码,而ARV的6C由S4编码。本分离株与ARV其他毒株一样其5’端和3’端都存在保守序列,分别是5’一GCUUUU,3'-UCAUC。同源性分析表明GRV JS2012毒株与GRV 03G株相比,其核苷酸同源性高达89.7%-99.1%。与鸭源呼肠孤病毒DRV J18基因序列的同源性达20.4%-96.9%,其中以L1、L2、M1及S2的基因变异性较大；与鸡源呼肠孤病毒ARV S1133株基因序列同源性达20.8%-77.0%。由此,我们认为应该将GRVJS2012归属于水禽呼肠孤病毒属,而与鸡呼肠孤病毒不同属。基因系统进化树分析表明,本分离株与鹅源呼肠孤病毒同属一支,而与鸭呼肠孤病毒存在一定的差异,与鸡呼肠孤病毒处在不同分支。由此可知,不同的呼肠孤病毒毒株之间存在着遗传多样性。而不同毒株之间是否存在基因重组的现象仍需进一步的探讨。本实验的研究进展为本病毒的进一步研究提供了可靠的依据。
【图文】：

Ａ逦Ｂ逡逑图２－２；邋ＣＥＦ感染结果。Ａ：病变沮，Ｂ：正常组逡逑Ｆｉｇ邋２－２；邋Ｔｈｅ邋Ｋｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｖｉｒｕｓ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ＣＥＦ．邋Ａ：邋ｖｉｍｓ－ｉｎｆｅｃ邋化邋ｄ邋ＣＥＦ．Ｂ：ｎｏｒｍａｌ邋ＣＥＦ逡逑３N４电镜观祭结果逡逑负染电镜观察。结果可知本病毒粒子无囊膜，呈球形，可见有双层衣壳结构，，直径在逡逑６０－８０ｎｍ邋么间（图邋２－３）。逡逑

图２－２；邋ＣＥＦ感染结果
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：2554966