蓝舌病病毒15型VP2、NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

发布时间：2019-11-06 23:44

【摘要】：蓝舌病(Bluetongue disease,BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的,由传播媒介库蠓在动物间广泛传播的急性、烈性动物传染病。该病主要感染反刍动物(山羊、绵羊、牛、鹿、骆驼等),其中以绵羊最易感,病畜被感染后主要表现出高热、口腔黏膜发绀充血、面部水肿等症状,部分血清型可引起较高的死亡率。目前,BTV已多达27个血清型,各血清型之间无交叉保护作用,所以制备出针对某一特定血清型的BTV相关的诊断试剂是防治该病的最有效措施。BTV属于呼肠孤病毒科环状病毒属的成员,其基因组由10个分节段的双股正链RNA组成,分别编码7种结构蛋白(VP1~VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a及NS4)。其中,VP2能刺激产生型特异性中和抗体,NS3/NS3a参与病毒的释放。根据Genbank中登陆的BTV15 L2基因序列(CAE51102.1)及S10基因序列(AGJ83560.1)分别设计一对特异性引物,以实验室构建的分别含有BTV15的VP2编码序列以及NS3编码序列的重组质粒p ZERO-B15-VP2和PEASY-B15-NS3为模板扩增VP2与NS3蛋白的编码基因。并将两者酶切处理后克隆于原核表达载体p MAL-C4X,构建重组表达质粒p C4X-B15-VP2和p C4X-B15-NS3。另外,将L2基因克隆于真核表达载体p Fast BacTMHTA用于真核表达VP2蛋白;将S10基因克隆于原核表达载体PET-30a,构建重组表达质粒PET-B15-NS3。四种蛋白表达纯化完成后,将原核重组VP2蛋白MBP-VP2和原核重组NS3蛋白HIS-NS3分别免疫4-6周龄的BALB/c小鼠以制备单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb)。取抗体滴度较高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,并分别以真核重组VP2蛋白BAC-B15-VP2和原核重组NS3蛋白M BP-NS3为包被抗原,以间接ELI SA方法对杂交瘤细胞进行筛选,最后获得3株稳定分泌抗BTV15VP2蛋白MAb的杂交瘤细胞,分别命名为2C6、2D6、3B11;获得4株稳定分泌抗BTV15 NS3蛋白M Ab的杂交瘤细胞。分别命名为1B5、2B12、2G9、3D8。利用western-blot(WB)和IFA试验对上述MAbs进行特异性鉴定,WB结果表明7株MAbs都能识别BTV15感染的BHK-21细胞内的相应蛋白;IFA结果表明2C6、2D6、3B11只与BTV15反应,而不与其他血清型BTV反应,而1B5、2B12、2G9、3D8与BTV1~24均发生反应。利用肽扫描技术对该几株MAbs识别的B细胞表位进行鉴定,结果表明2C6识别的抗原表位为62LKYRP66,2D6识别15IAPAIIKRYP24,3B11识别99DHDVDS104;1B5识别的抗原表位为205YNDAVRM SF213,2B12识别204SYNDAVRM SF213,2G9识别82AEAFRDDVRLRQIK95,3D8识别36PPRYA40。对不同血清型BTV的VP2序列及NS3序列进行序列比对,结果表明BTV不同血清型间针对VP2的表位序列相似性较低,而针对NS3的表位序列相似性较高。本研究通过制备针对BTV15 VP2和NS3的MAbs及鉴定其抗原表位,以期为BTV15特异性抗原检测诊断方法的建立以及BTV群特异性鉴定奠定一定的基础,并在对BTV的基础研究方面也有重要的意义。
【图文】：

蛋白,阴阳性

图 2-4 BTV15 VP2 蛋白 3 株 Mabs 与天然 BTV15 VP2 蛋白 WB 鉴定Fig.2-4 The reactivity of anti-BTV15 VP2 M abs with native BTV15 VP2 protein by Wained protein marker; lane 1: lysate of uninfected BHK-21 cells; lane 2:BHK21 cell infected验中，在未感染病毒细胞对照及阴阳性对照作用下，3株MAbs 均只与B胞发生反应(图2-5)，而不与BTV1~14、BTV16~24、IBAV以及CV感染的B图未列出)，结果表明3株MAbs均具有良好的型特异性。 2 3

蓝舌病病毒15型VP2、NS3蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

BTV15VP2MAbs的IFA试验
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】