表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用

发布时间：2019-11-07 17:34

【摘要】：为研究猪Viperin蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的抑制作用,通过RTPCR方法扩增猪Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV,经菌液PCR、酶切鉴定后进行测序。将PmeⅠ内切酶线性化的重组穿梭载体质粒(p Ad Track-s VIP)电转化大肠杆菌BJ5183,与腺病毒骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒质粒,经内切酶PacⅠ线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重组腺病毒r Ad-s VIP感染细胞后,可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR、Western blot检测结果表明,重组腺病毒r Ad-s VIP可正确表达猪Viperin蛋白,且表达的猪Viperin蛋白具有良好的反应原性,对PRRSV的复制具有明显的抑制作用。
【图文】：

CO2条件下培养24h，接种PＲＲSV(BB0907)病毒液(MOI=0．01)，37℃培养48h。分别收集细胞，用细胞裂解液充分裂解细胞，然后用BCA蛋白质定量试剂盒检测蛋白质浓度，Westernblot检测PAM细胞内猪Viperin蛋白的表达和PＲＲSV在细胞内复制情况，以β－actin为内参。其中，一抗分别为鼠抗猪Viperin多克隆抗体、PＲＲSVN蛋白单克隆抗体、β－actin单克隆抗体，二抗为羊抗鼠HＲP－IgG。2结果与分析2．1猪Viperin基因PCＲ扩增结果以pEASY－sVIP为模板，应用引物rAd－F、rAd－Ｒ进行PCＲ扩增，可见与预期大小一致的条带(图1)。M．DNAMarker5000;1．PCＲ扩增产物图1猪Viperin基因的扩增结果2．2腺病毒穿梭载体pAdTrack－sVIP的构建与鉴定结果构建的重组穿梭载体pAdTrack－sVIP经HindⅢ和XhoⅠ进行酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见约1089bp的目的片段，与预期片段大小相符(图2)。将酶切鉴定正确的重组穿梭载体pAdTrack－sVIP进行测序，测序结果采用DANStar128

第9期方剑玉等:表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PＲＲSV复制的抑制作用软件与已知猪Viperin序列进行比较发现，成功构建了重组穿梭载体。M．DNAMarker5000;1．pAdTrack－sVIP质粒图2重组穿梭载体pAdTrack－sVIP的酶切鉴定结果2．3重组腺病毒质粒pAd－sVIP的鉴定结果将重组穿梭质粒pAdTrack－sVIP线性化后，电转化含腺病毒骨架质粒pADEasy－1的大肠杆菌感受态细胞BJ5183，提取质粒进行酶切鉴定，经1%琼脂糖凝胶电泳可见2个条带，与预期结果相符，表明已成功将Viperin基因克隆入腺病毒基因组(图3)。M．DNAMarker15000;1．pAd－sVIP质粒图3重组腺病毒质粒pAd－sVIP酶切鉴定结果2．4重组腺病毒的转染与病毒收获将线性化的重组腺病毒质粒pAd－sVIP转染HEK－293A细胞后，荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达(图4)，同时，显微镜下可见特异性细胞病变。A．转染pAd－sVIP质粒的HEK－293A细胞;B．空白HEK－293A细胞图4重组腺病毒质粒pAd－sVIP转染HEK－293A细胞后的绿色荧光蛋白表达情况2．5重组腺病毒rAd－sVIP外源基因的表达与鉴定2．5．1ＲT－PCＲ检测猪Viperin基因的表达收集重组腺病毒和野生型腺病毒的病毒液，用ＲNA提取试剂盒提取总ＲNA，，反转录成cDNA后进行PCＲ扩增，扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，可观察到约1089bp大小的目的条带，而野生型腺病毒无条带(图5)。表明重组腺病毒可正确表达猪Viperin基因。M．DNAMarker5000;1．野生型腺病毒rAd－wt对照;2．重组腺病毒rAd－sVIP图5PCＲ检测重组腺病毒rAd－sVIP猪Viperin基因表达情况2．5．2Westernblot鉴定猪Viperin的表达Wes-ternblot结果显示，重组腺病毒组出现特异性条带，而野生型腺病毒组无条带，表明重组腺病毒可正确表达猪Viperin蛋白(图6)。图6W

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本文编号：2557387