猪丁型冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

发布时间：2019-11-09 12:24

【摘要】：猪丁型冠状病毒(PDCoV)是2014年检测出的一种新型猪源肠道冠状病毒,对养殖业造成严重的经济损失。为建立快速检测PDCoV的血清学方法,本研究以原核表达的PDCoVN重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PDCoV重组N蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的PDCoV重组N蛋白约为28ku,westernblot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的PDCoV抗体间接ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒等7种主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法检测灵敏度较高、重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于10%;采用该ELISA方法对我国2014年~2016年间采集的不同地区猪场的100份临床血清样品进行了检测,阳性率高于45.9%,表明我国猪群中存在PDCoV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PDCoV抗体,是PDCoV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。
【图文】：

M:ProteinMarker;1:Totalbacteria;2:Supernatant;3:Precipitate;4-6:Purifiedprotein图1重组N蛋白表达的鉴定Fig.1IdentificationofrecombinantNproteinexpressionwesternblot鉴定。1.6间接ELISA方法的建立及反应条件的优化将纯化的重组蛋白作为抗原用包被液依次做1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀释，按100μL/孔滴加到聚苯乙烯微量滴定板中，4℃包被过夜。弃液，PBST洗3次，200μL/孔，每次3min～5min。用5%脱脂乳(PBST稀释)按200μL/孔的量封闭1h，弃去封闭液后按上述方法洗涤。将PDCoV阴阳性血清分别依次做1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀释(2%脱脂乳稀释)，组成方阵，100μL/孔，37℃作用1h，，弃液后按上述方法洗涤，加入1∶10000稀释(2%脱脂乳稀释)的羊抗猪lgG-HRP，100μL/孔，37℃作用1h，弃液，按上述方法洗涤，加入单组分TMB显色液，100μL/孔，室温避光显色10min，加入终止液终止反应，用酶标仪读取OD450nm值。比较阴阳性血清的OD450nm值，选取阳性血清OD450nm值为1.0左右，阴性OD450nm值为0.2以下，且阳性与阴性OD450nm比值(P/N)最大时的抗原包被浓度为抗原最佳包被浓度，对应的阴阳性血清稀释度为血清最佳稀释度。同时对抗原包被时间、封闭液的选择及作用时间、最佳一抗作用时间、酶标二抗稀释倍数和作用时间、底物显色时间等进行优化。1.7阴阳性临界值的确定按最适抗原包被浓度包被ELISA板，按优化后的间接ELISA方法筛选临床血清，选取其中OD450nm值<0.3的血清72份，计算S/P值，S/P值=(样品血清OD450nm值-阴性血清OD450nm值)/(阳性血清OD450nm值-阴性血清OD450nm值)，计算各血清S/P值的平均值X及标准方差SD，当样品S/P值<X+2SD时，判为阴性；样品S/P值>X+

?5.95%(17/37)，可见2014年～2016年间血清样品的阳性率均在50%左右，阳性率较高(表5)。表1间接ELISA反应条件的优化Table1Theoptimizationofindirect-ELISA最佳稀释度Optimizeddilutions反应条件ReactingConditions重组N蛋白为包被抗原CoatedwithrecombinantNprotein1:80(0.466μg/100μL)4℃/12h+37℃/60min5%skimmilk37℃/60min待检样品Untestedsamples1:4037℃/30min羊抗猪lgG-HRPGoatAnti-piglgG-HRP1:1000037℃/30min显色时间Colorreactiontime10min图2阴性样品OD450nm结果正态分布图Fig.2TheOD450nmvaluesofnegativesamples'normaldistributiondiagram表2ELISA特异性试验结果Table2ThespecificitytestofIndirectELISA血清SerumX(OD450nm)S/P结果判定ResultsCSFV0.098-0.066-PRRSV0.093-0.07-PRV0.094-0.069-FMDV0.2390.042-PCV20.114-0.054-PEDV0.2940.085-TGEV0.410.174-+1.484-0.184表3ELISA敏感性试验结果Table3ThesusceptibilitytestofIndirectELISA阳性血清Positiveserums1231∶401.5371.5101.0961∶800.7440.7080.5941∶1600.4140.4060.3441∶3200.3100.2200.1611∶6400.0880.0880.0151∶12800.000-0.016-0.0281∶2560-0.041-0.062-0.059血清稀释度Serumdilutions表4间接ELISA重复性试验(n=8)Table4RepeatabilityassayforindirectELISA(n=8）血清编号Serumnumbers12345678平均数X±SD0.423±0.030.86±0.0370.563±0.0530.652±0.0570.719±0.0021.026±0.0280.156±0.0

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本文编号：2558441