玉米赤霉烯酮诱发睾丸间质肿瘤机制的体外研究

发布时间：2019-11-10 20:30

【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEA)是存在于谷物、啤酒、牛奶等食品中的类雌激素霉菌毒素,可严重影响动物及人类的健康。研究发现ZEA不仅具有生殖毒性、肝毒性、遗传毒性、免疫毒性,还可引起动物睾丸间质肿瘤的发生,但关于ZEA诱发睾丸间质肿瘤的机制目前尚不明确。本实验以小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞)为材料,研究了低浓度的ZEA暴露对TM3细胞的细胞增殖活力、细胞凋亡、细胞周期及其相关调控蛋白的影响,DNA损伤及原癌、抑癌基因的影响,细胞间隙连接通讯及其连接蛋白的影响,以揭示ZEA诱发睾丸间质肿瘤的机制。主要研究内容如下：1.ZEA对TM3细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。不同浓度的ZEA(0、5、10、20μg/L),染毒TM3细胞72h,应用MTT法检测ZEA染毒后对TM3细胞增殖活力的影响；AnnexinV-FITC/PI双荧光染料对细胞进行染色,流式细胞仪检测ZEA染毒TM3细胞凋亡情况,同时通过PI荧光染色法检测细胞周期的变化；通过免疫印迹法(Western Blot)检测凋亡调控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4, Bcl-2基因家族成员的表达情况。结果显示,低浓度ZEA对TM3细胞的增殖具有促进作用,且存在剂量-效应关系,在ZEA染毒浓度为20μg/L时,TM3细胞的相对增殖活力明显提高(P0.05); ZEA染毒后,分布于G1/G0期的TM3细胞量逐渐减少,开始向S期和G2期进行转化,而细胞周期调控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4蛋白表达量随ZEA染毒浓度的升高而呈上升趋势；细胞凋亡检测结果显示,10、20μg/L ZEA染毒后TM3细胞的凋亡率极显著下降(P0.01),但20μg/L ZEA染毒组较10μg/L ZEA染毒组凋亡率略有上升(P0.05)；与对照组比较,各染毒组凋亡调控蛋白Bax/Bcl-2灰度值比值均显著降低(P0.05)。2.ZEA对TM3细胞DNA损伤及原癌、抑癌基因的调控作用。ZEA染毒TM3细胞72h,应用Western Blot检测磷酸化组蛋白yH2AX的蛋白表达水平,同时检测原癌基因c-Myc、c-Fos、c-Jun,抑癌基因p53、PTEN的蛋白表达水平：免疫荧光法检测yH2AX灭光焦点的形成情况。结果显示,TM3细胞内形成的yH2AX荧光焦点数量及形成荧光焦点的细胞数量都随着ZEA染毒浓度的升高而增加,20μg/L ZEA染毒组只有26.21%的细胞未形成荧光焦点,其余细胞均有不同程度的DNA损伤；与对照组比较,各染毒组yH2AX蛋白表达量均显著升高(P0.05)；随着ZEA染毒浓度的升高,原癌基因c-Myc、c-Fo c-Jun蛋白表达水平呈上升趋势,各染毒组与对照组比较均有显著差异(P0.05),相反抑癌基因p53及PTEN蛋白表达水平则呈下降趋势,且差异极显著(P0.01)。3.ZEA对TM3细胞间隙连接通讯及其连接蛋白的影响。ZEA染毒TM3细胞72h。Western Blot检测细胞间隙连接蛋白Cx32、Cx43的蛋白表达水平；FITC荧光染料染色Cx43,在荧光显微镜下观察Cx43在细胞内的分布情况；划痕标记染料示踪技术(SLDT法)检测TM3细胞暴露于ZEA后,相邻细胞之间GJIC功能的变化。结果显示,随着ZEA染毒浓度的升高,TM3细胞连接蛋白Cx32、Cx43的表达量呈下降趋势,各染毒组与对照组比较均有显著差异(P0.05)；荧光显微镜下观察到Cx43在正常细胞内呈现点线状结构分布于细胞膜周围,然而在ZEA染毒后Cx43原有的点线状结构遭受破坏,荧光强度减弱,其分布逐渐趋向于细胞质和细胞核膜上；SLDT技术检测发现小分子染料荧光黄(LY)在相邻细胞间的扩散距离随着ZEA染毒浓度的升高而呈现缩短趋势,10μg/L ZEA以上染毒组均较对照组有极显著差异(P0.01),表明GJIC功能受到了ZEA的抑制。结论认为,低剂量ZEA可引起TM3细胞DNA的损伤,同时伴随原癌、抑癌基因及凋亡调控蛋白Bal-2、Bax表达的异常及细胞间隙连接通讯的抑制,这些被认为是肿瘤发生的关键机制。ZEA可导致TM3细胞基因组稳定性降低,其生长调控机制的平衡状态遭受破坏,细胞增殖、分化发生异常变化,若细胞的持续增殖及恶性转化未及时受到抑制,最终可导致肿瘤的发生。
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进行了统计和研究，发现除甲状腺癌受遗传因素影响较大外，其余１４种最常见的癌症的逡逑发生主要受到环境因素的影响这与日益严重的空气、止地、水源及食品污染密不可分。逡逑如图１－２所示，Ｈａｎａｈａｎ在报道中提出了癌症的六大特征，包括诱导血管生成，避免细胞逡逑死亡，避免细胞生长受到抑制，持续的细胞增殖信号，侵袭和转移的激活Ｗ及细胞无限增逡逑值的潜能ｔＷ。微环境的变化与信号之间的相互作用是肿瘤发生的关键。逡逑逦ｍｍａｍ逡逑图１－２邋癌症发生的六大信号（引自Ｈａｎａｈａｎ邋Ｄ邋ａｎｄ邋Ｗｅｉｎｂｅｒｇ邋Ｒ．邋Ｃｅｌｌｓ邋２０００；邋１００（１）：邋５７－７０．）逡逑‘，

本文编号：2559021