日本血吸虫Wnt分泌相关蛋白的抑制研究及Wnt1的鉴定分析

发布时间：2019-11-14 03:19

【摘要】：血吸虫(Schistosome)感染人及多种哺乳动物,具有重要公共卫生意义。Wnt信号通路是参与调控胚胎形态发育和生长,成体组织内环境的稳态等生物学过程的保守的信号通路。Wnt蛋白的分泌对Wnt信号通路的开启具有重要意义,本研究利用Wnt信号蛋白分泌抑制剂及RNA干扰Wnt信号蛋白分泌相关基因(Porcupine及Wntless)来阻碍Wnt蛋白的分泌,探索Wnt信号通路转导的抑制对日本血吸虫生长发育及内环境稳态的影响;同时,对日本血吸虫Wnt1基因进行鉴定。1.日本血吸虫Wnt分泌相关蛋白的抑制研究选择以Porcn为靶点的Wnt信号蛋白分泌抑制剂C59给体外培养血吸虫添加及给感染血吸虫的小鼠口服,观察对体外培养和宿主体内生长虫体的Wnt信号通路的调节及产生的生物学效应。利用荧光定量PCR技术对Wnt信号通路成员基因mRNA水平进行比较,确定20 nmol/L为C59的最佳作用浓度;添加C59的第6天,体外培养的14天童虫的Wnt信号通路开始受到相对持续的抑制;添加C59的第7天体外培养的7天及14天童虫作用虫体的Wnt信号通路受到抑制程度最大;C59对14天童虫Wnt信号通路的抑制效果要比7天童虫更明显。荧光定量PCR分析,结果显示C59处理的7天童虫及14天童虫的促凋亡相关因子及DNA损伤相关因子的转录水平均有不同程度的上调,且14天虫体这些基因的转录水平上调的程度更大,推测是Wnt信号通路的抑制程度越大,细胞就更趋于凋亡。体外培养的14天虫体的扫描电镜结果显示:C59组虫体与DMSO组及空白对照组相比,体表结构没有明显差别,表明C59的添加未对虫体的体被屏障产生直接的刺激和损伤。透射电镜结果显示:C59组虫体超微结构模糊不清,肠腔上皮脱落,肠管微绒毛较少、断裂等变化,推测是由于Wnt信号通路的抑制导致内环境不能维持稳定,引起细胞凋亡甚至坏死,这与C59组凋亡相关基因表达上调的结果吻合。C59作用于体内寄生的日本血吸虫的研究结果显示,可引起虫体大部分Wnt信号通路成员转录水平下调,其中Wnt/β-catenin信号通路的成员基因及Wnt/Ca2+信号通路成员基因下调程度相对较大,推测童虫阶段Wnt/β-catenin信号通路及Wnt/Ca2+信号通路的调节功能活跃;C59可用于对宿主体内虫体Wnt信号通路的抑制实验。通过Race技术获得SjPorcn蛋白基因的全序列;其编码的氨基酸序列存在三个高度保守的氨基酸残基;利用RNA干扰SjPorcn,使其表达下调,也可引起类似C59对虫体Wnt信号通路产生的作用,导致Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+信号通路不同程度的抑制。克隆鉴定了日本血吸虫的Wntless基因(SjWls)。序列分析显示,SjWls氨基酸序列羧基末端为KEAFE并有一个保守的赖氨酸残基,该序列可能与SjWls的亚细胞定位相关。SjWls蛋白在虫体的组织定位分析,结果显示SjWls蛋白广泛分布于虫体吸盘、抱雌沟及生殖器官等组织中,表明Wls蛋白在各个组织中都有分布。利用RNA干扰SjWls,使其表达下调可以引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+信号通路不同程度的抑制。2.日本血吸虫Wnt1基因鉴定及在不同发育阶段表达水平分析克隆鉴定了日本血吸虫的Wnt1基因(SjWnt1)。序列分析显示,SjWnt1蛋白有Wnt信号蛋白家族的结构功能域,但比高等生物的Wnt1少一个保守的Cys。mRNA和蛋白的定量分析结果显示,SjWnt1表达于血吸虫的整个发育过程,而在虫卵和早期童虫中呈高表达水平,提示SjWnt1对卵胚发育和早期童虫的细胞分化具有调节作用。来源于非适宜宿主及单性感染的发育不良虫体中SjWnt1 mRNA水平比发育正常的虫体高,表明不良发育的虫体相应的Wnt信号阻滞。SjWnt1表达下调后则引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路的相应下游基因的mRNA水平下降,推测SjWnt1可能通过这3种传递途径行使信号传递的功能。本文开展了日本血吸虫Wnt分泌相关基因的抑制研究。确定了Porcn蛋白的专性抑制物C59的最佳作用浓度及时效,并分析了C59对体、内外童虫Wnt信号通路的抑制效果。筛选出两个Wnt蛋白分泌相关基因:Porcn及Wls的siRNA,并分析了Porcn及Wls基因下调对Wnt信号通路的抑制效果。为从整体上抑制血吸虫的Wnt家族蛋白,探讨该通路对血吸虫生长发育调控的分子机制建立了实验方法。另外,在前期研究工作的基础上,对SjWnt1进行了鉴定和分析,为认识SjWnt1在血吸虫发育中的调节功能提供实验基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.7

【参考文献】