gga-miR-21-5p靶向调控SATB1基因及其对马立克氏病肿瘤细胞增殖与迁移的影响

发布时间：2019-11-15 23:01

【摘要】：马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的一种高度传染的病毒性肿瘤疾病,对养禽业造成巨大经济损失。不同品种(系)鸡对马立克氏病(MD)具有不同的遗传抗性,遗传抗性较强的鸡可能会长期停留在潜伏感染阶段,在经历一个短暂的晚期溶细胞感染后形成肿瘤,而易感鸡体内病毒不断增殖,未出现肿瘤即早期死亡,造成抗性鸡与易感鸡肿瘤形成差异的分子调控机制至今并未阐明。近年研究发现宿主miRNA具有抗病毒免疫应答功能很可能在其中发挥着关键作用。我们前期以自主培育的B21(抗性)和B19(易感)单倍型鸡为模型,利用高通量测序技术构建了B21和B19鸡在MDV病毒感染三个关键阶段(5、10和21dpi)法氏囊组织miRNA的差异表达谱,筛选出一些可能与MHC-B单倍型鸡MD抗性相关的miRNA。为从宿主miRNA调控角度进一步探索抗性鸡与易感鸡肿瘤形成差异的分子机制,本实验在前期差异表达谱的基础上选择gga-miR-21-5p和gga-miR-146b-5p为对象进行深入研究。我们首先利用实时荧光定量PCR验证高通量测序结果,并进一步分析gga-miR-21-5p和gga-miR-146b-5p在其它免疫器官的表达情况,结果发现gga-miR-21-5p和gga-miR-146b-5p在抗性鸡和易感鸡感染后的法氏囊和脾脏组织中表达量明显高于非感染组。进一步利用TargetScan和miRDB两个靶基因预测软件预测gga-miR-21-5p和gga-miR-146b-5p的靶基因,取两个软件预测交集并结合免疫相关通路分析进行筛选。gga-miR-21-5p选取SATB1、TIAM1和PITX2,gga-mi R-146b-5p选取NOVA1、DOT1L和NFATC2作为候选基因进行验证。通过双荧光酶素报告分析,我们发现gga-miR-21-5p可显著抑制SATB1 3’-UTR区的报告基因活性,使其下调33%,表明gga-miR-21-5p与预测靶基因SATB1之间存在相互作用。同时,Western blot分析发现,在转染MSB-1细胞72小时后,gga-mi R-21-5p过表达显著抑制SATB1蛋白表达,相反抑制gga-miR-21-5p表达会促进SATB1蛋白表达。为了进一步检测gga-miR-21-5p对MSB-1细胞增殖和迁移的影响,我们利用CCK-8和trans-well的方法进行检测,发现在转染外源gga-miR-21模拟物和抑制剂24-72小时后MSB-1细胞过表达细胞增殖速度呈显著下降趋势。同时,过表达gga-miR-21后,MSB-1细胞迁移能力也显著下降。本研究表明gga-mi R-21-5p可以靶向调控SATB1基因表达,并且对马立克氏病肿瘤细胞的增殖与迁移具有一定的抑制作用。
【图文】：

双荧光,载体,重组载体

图 3-1 pmirGLO 双荧光素酶表达载体Figure 3-1 Information of pmirGLO Vector3.2.4.2 重组载体的转化

靶基因

M NOVA1 DOT1L DOT1L NFATC2 NFATC2图 3-2 gga-miR-21-5p 靶基因扩增Figure 3-2 The target gene amplification of gga-miR-21-5p
【学位授予单位】：牡丹江师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.31

【参考文献】