Jiv蛋白对猪瘟病毒复制的作用及猪瘟病毒C株感染性克隆的构建
发布时间：2019-11-29 16:25
【摘要】：猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)与牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)同为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的重要成员。CSFV的持续性感染是猪瘟难以根除的原因之一,对CSFV致病机理的阐明是制定有效防控措施的前提和基础。病毒在宿主细胞内的复制增殖,除了自身编码一些必需蛋白外,还需要宿主细胞多种成分的协助。分子伴侣(Molecular chaperone)是协助细胞在正常和胁迫条件下保持细胞内稳态的重要蛋白组分,并参与许多细胞生理反应过程。J-结构蛋白(J-domain protein interacting with viral protein,Jiv)是属于热休克蛋白40家族(Heat-shock proteins 40,HSPs 40)的分子伴侣,在BVDV的感染和致病中发挥着重要作用。CSFV与BVDV的相关研究资料可相互借鉴。BVDV在自然界中有两种不同的表现型,其中有宿主Jiv基因嵌合的毒株具有致细胞病变(CPE)的特性。这种现象也出现在CSFV的研究当中。BVDV的研究发现Jiv蛋白主要通过促进NS2-3蛋白的切割进而促进病毒的复制。本研究验证了Jiv蛋白核心区对CSFV复制的影响及其与病毒蛋白的相互作用,为筛选Jiv重组病毒的嵌合片段奠定基础。此外,克隆获得了CSFV C株全基因组c DNA,构建了C株的感染性克隆并进行了病毒的初步拯救。研究获得以下结果:1.通过构建Jiv蛋白核心区段的过表达和干扰质粒对细胞内Jiv进行过表达和干扰,验证了Jiv蛋白在CSFV复制中的促进作用。通过Co-IP的方法验证了Jiv蛋白与CSFV蛋白的相互作用。2.根据CSFV AF531433毒株的全基因组序列设计引物,利用RT-PCR及重叠延伸PCR的方法扩增获得覆盖全基因组的8个片段。在基因组的5′端分别引入T7启动子序列及CMV启动子、核酶序列,在其3′端分别引入线性化酶切位点、T7终止子序列及SV40 Poly A终止序列。获得两种包含该病毒全长c DNA克隆的感染性克隆p BR322-T7-CSFV及p BR322-CMV-CSFV。3.利用T7启动子,通过体外转录合成病毒RNA,检测其浓度后通过电击转染到ST细胞当中。利用CMV启动子将感染性克隆质粒转染PK15细胞进行病毒粒子拯救。对细胞连续传代后通过RT-PCR对病毒粒子核酸进行检测。
【图文】：
了病毒粒子的拯救(Meyers et al. 1996)。Ruggli 等人用 CSFV CAP 株替换 Alfort 对应段后构建出嵌合的 Alfort 感染性克隆并拯救出了嵌合病毒(Ruggli et al. 1996)。Van Gennip 等人于 1999 年对病毒拯救的方法进行了改进(van Gennip et al. 1999)他们建立起一株稳定表达 T7 RNA 聚合酶的 SK6 细胞系，省去了体外转录的操作直对构建好的 cDNA 克隆进行病毒的拯救。这一改进不仅简化了实验操作步骤，而且大提高了效率。利用长片段扩增技术，，Rasmussen 等人于 2010年以病毒总 RNA为模通过一次性扩增获得了 CSFV Paderborn 株、C 株以及 BVDV CP7 毒株的全基因组列，并成功进行了病毒的拯救，大大简化了感染性克隆的操作步骤(Rasmussen et 2010)。Li 等人在 2012 年利用真核细胞内的 II 型 RNA 聚合酶系统再一次对感染性克的构建进行了改进，使得操作更加简便、有效且构建的反向遗传系统更加稳定(Li et 2013)。该系统构建的感染性克隆在 CSFV 基因组的 5′添加了 CMV 启动子、内含子列、T7 启动子以及榔状核酶序列，保证了转录的启动效率以及重组质粒在菌体中传时的稳定性。在 3′端加入了 HDV 核酶序列、T7 终止子序列以及 SV40PolyA 序列有效保证了 3′端转录的终止（如图 2-2）。
3.3.3 过表达及干扰掉 Jiv 分子后对 CSFV 增殖的影响将正常 PK15细胞与过表达 Jiv分子及慢病毒 pCDH-U6- Jiv -sh2干扰 Jiv 的细时用 CSFV 进行感染。48 h 后收取细胞核酸样对病毒进行检测，结果表明 CSFV殖分别被促进和抑制（图 3-3）。说明 Jiv 分子在猪瘟病毒的复制过程中发挥了重用。图 3-2 Real-time PCR及 Western blot检测各质粒的的干扰效果Fig. 3-2 The result of knock down of Jiv detected by Real-time PCR and Western blot
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65
本文编号：2567538
【图文】：
了病毒粒子的拯救(Meyers et al. 1996)。Ruggli 等人用 CSFV CAP 株替换 Alfort 对应段后构建出嵌合的 Alfort 感染性克隆并拯救出了嵌合病毒(Ruggli et al. 1996)。Van Gennip 等人于 1999 年对病毒拯救的方法进行了改进(van Gennip et al. 1999)他们建立起一株稳定表达 T7 RNA 聚合酶的 SK6 细胞系，省去了体外转录的操作直对构建好的 cDNA 克隆进行病毒的拯救。这一改进不仅简化了实验操作步骤，而且大提高了效率。利用长片段扩增技术，，Rasmussen 等人于 2010年以病毒总 RNA为模通过一次性扩增获得了 CSFV Paderborn 株、C 株以及 BVDV CP7 毒株的全基因组列，并成功进行了病毒的拯救，大大简化了感染性克隆的操作步骤(Rasmussen et 2010)。Li 等人在 2012 年利用真核细胞内的 II 型 RNA 聚合酶系统再一次对感染性克的构建进行了改进，使得操作更加简便、有效且构建的反向遗传系统更加稳定(Li et 2013)。该系统构建的感染性克隆在 CSFV 基因组的 5′添加了 CMV 启动子、内含子列、T7 启动子以及榔状核酶序列，保证了转录的启动效率以及重组质粒在菌体中传时的稳定性。在 3′端加入了 HDV 核酶序列、T7 终止子序列以及 SV40PolyA 序列有效保证了 3′端转录的终止（如图 2-2）。
3.3.3 过表达及干扰掉 Jiv 分子后对 CSFV 增殖的影响将正常 PK15细胞与过表达 Jiv分子及慢病毒 pCDH-U6- Jiv -sh2干扰 Jiv 的细时用 CSFV 进行感染。48 h 后收取细胞核酸样对病毒进行检测，结果表明 CSFV殖分别被促进和抑制（图 3-3）。说明 Jiv 分子在猪瘟病毒的复制过程中发挥了重用。图 3-2 Real-time PCR及 Western blot检测各质粒的的干扰效果Fig. 3-2 The result of knock down of Jiv detected by Real-time PCR and Western blot
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65
【参考文献】
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1 翁善钢;;猪瘟的流行史和现状[J];中国猪业;2011年03期
本文编号：2567538
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