【摘要】：反刍动物瘤胃能很高效的利用饲料中的粗饲料,并作为其主要的能量来源,主要因为瘤胃内有大量分解纤维素的纤维素分解菌。瘤胃纤维素菌大多数是严格厌氧菌,然而也存在兼性厌氧纤维素菌。我们实验室前期通过体外培养试验发现,将从奶牛瘤胃内分离的的兼性厌氧纤维素菌和固氮菌混合添加时,能够调节瘤胃的内环境、并提高饲料的降解率。然而,兼性厌氧纤维菌是瘤胃内固有的,还是从外界进入的,目前还很少有人研究。由于瘤胃对于饲料是个“开放”的环境,一些兼性厌氧纤维菌和固氮菌可能随饲料进入瘤胃。我们推测在采食后一定时间内的有氧环境中,兼性厌氧菌可能对发酵起到了一定作用。本试验选取一种从瘤胃液中分离的兼性厌氧固氮菌和从瘤胃液、土壤、饲料三种来源分离的兼性厌氧纤维素菌混合,探讨其对体外发酵的影响。试验1:菌种的复活与计数试验选用的菌株由我所在实验室前期分离自饲料、瘤胃液、土壤,包括兼性厌氧纤维素菌和固氮菌。菌液与30%甘油以1:1比例混合保存在-20℃的冰箱中。每种来源选取高纤维素酶活性和低纤维素酶活性各一株,并使不同来源菌具有相近的纤维素酶活性。选定的纤维素菌株分别为:从土壤中分离的T1(2.576U·mL-1)和T4(0.351U·m L-1)、从饲料分离的S1(2.824U·mL-1)和S4(0.345U·m L-1)、以及从瘤胃液分离的L6(3.199U·m L-1)和L4(0.593U·m L-1)。另外,选取一株从瘤胃液分离的兼性厌氧固氮菌L5(17.637U·m L-1)。将所选取的菌株从冰箱中取出、解冻,然后进行复活、增殖培养。试验2:混合菌对体外发酵的影响将试验1培养好的6个兼性厌氧纤维菌和兼性厌氧固氮菌混合(比例为4:1),形成6种混合菌,分别记为L4,S1,T4,L6,S4和T1,用其进行体外发酵试验。试验在体外培养装置上完成,装置主要由HZS-H型恒温水浴摇床和100 m L的注射器组成。本试验包括6个试验组和1个对照组,每组7个重复(即7个注射器)。向每个注射器内装入0.200 g(精确到0.001 g)发酵底物(精:粗=45:55),加入1 m L的混合菌液(添加菌量均为1.2×109 CFU/m L,对照组内加入1 ml灭活的混合菌液)和30 mL培养液,放入体外发酵培养装置中进行发酵试验。当发酵进行至2、4、8、12、24小时,记录注射器的读数(即产气量)。培养24 h发酵结束,将注射器内全部培养物取出,并立即用酸度计测定pH,然后将培养物以3 500 r/min离心15 min,上清液分别装入不同的离心管中,放置-20℃冰箱冷冻保存,待测氨态氮(NH_3-N)、菌体蛋白(MCP)、挥发性脂肪酸(VFA)和滤纸酶活性、羧甲基纤维素钠(CMC)酶活性、β-葡萄糖苷酶活性;另取上清液保存在-80℃冰箱,用于三种纤维素菌测定。沉淀用于测定干物质降解率(DMD)。结果表明:加入混合菌的试验组与对照组相比,加入混合菌的试验组与对照组相比,各试验组产气量显著升高(P0.05);各试验组的DMD与对照组相比均有显著提高(P0.05),其中T1试验组的DMD最高,而T4试验组的DMD最低;各试验组对pH的影响显著提高(P0.05),其中L4试验组的pH最高,T1试验组的pH最低;各试验组与对照组相比对NH_3-N的浓度的影响有显著的提高(P0.05),其中T1试验组最高,L4、L6、T4试验组相对较高;各试验组的MCP浓度与对照组相比有显著的提高(P0.05);各试验组对VFA浓度的影响有显著提高(P0.05),且低于对照组,L4、试验组的VFA浓度最高,T1试验组的VFA浓度最低;各试验组对纤维素酶活的影响显著均高于对照组,试验组中L4的滤纸酶活性最高,S1的滤纸酶酶活性最低、L4试验组的CMC酶活性最高,β-葡萄糖苷酶活基本相近;加入混合菌后试验组与对照组相比对白色瘤胃球菌的菌群数量的影响显著变少(P0.05),然而对黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌却有明显的增加(P0.05)。低纤维素酶活与高纤维素相比对产气量、pH、VFA、NH_3-N、均有显著影响。然而对滤纸酶活性、CMC酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、DMD、及MCP等没有显著影响(P0.05)。综上所述,添加的混合菌均促进了体外发酵;分离自瘤胃液的低纤维酶活性兼性厌氧纤维菌(L4)与分离自瘤胃内兼性厌氧固氮菌(L5)混合效果最好;低纤维素酶活性的兼性厌氧纤维菌的促进发酵作用好于高纤维素酶活性兼性厌氧纤维菌。
【图文】：
固氮菌的活化：同上。2.1.2 CFU 平板计数法将复活好的菌株进行平板计数。CFU 即为菌落形成单位，，是平板计数法的常用单位。微生物平板计数方法简介：对每个样品使用 3 个稀释度，且每个稀释度做 3 个重复，关于 CFU统计值的准确性，是与微生物检测允许误差、如何对平板菌落进行正确计数以及 3 个稀释度以哪一个稀释度进行计数等问题密切相关的，然而这些问题饲料标准中并未有所规定。2.1.2.1 平板制作（1）将培养皿洗净并干燥（注意此时要将各培养皿盖方向一致），用报纸包好（注明皿盖的方向），对其进行高压或干燥灭菌后备用。（2）先取刚灭菌后但尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，稍微打开灭菌过的培养皿盖（露一小缝），倒入培养基（无氮培养基羧和甲基纤维素钠培养基，厚度为 0.5 cm），封盖后冷凝并倒置备用。然后按照平板计数法分别将 3 种来源纤维素分解菌和分离自瘤胃液中固氮菌的数量计出。图 2-1 为 CFU 计数法具体示意图（纤维素分解菌与固氮菌计数方法相同）。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S816.3
【参考文献】
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