结核分枝杆菌CFP-10、ESAT-6及CFP-10-ESAT-6对RAW264.7细胞凋亡及相关机制的研究

发布时间：2020-01-31 12:13

【摘要】：结核病(Tuberculosis)是一种因感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)而引发的人畜共患传染性疾病,其致死率仅次于艾滋病。肺泡巨噬细胞是MTB在体内潜伏的主要场所,同时也是抑制MTB在体内传播的屏障。MTB在体内是潜伏还是传播取决于MTB与宿主特别是巨噬细胞之间的相互作用,在这一作用过程中许多MTB蛋白发挥重要作用。所有BCG疫苗株比致病性结核分枝杆菌缺失RD1-RD16共16个差异区域(region of difference,RDs),研究表明这或许是分枝杆菌毒力衰减的主要因素,因此研究RD1区蛋白在宿主细胞内的免疫过程,了解其致病机制,一直是近年来人们研究的热点。本研究首先克隆RD-1区所有基因,插入pMD-18T载体后测序验证。然后用带酶切位点的引物克隆Rv3872、Rv3873、CFP-10(10 kDa culture filtrate antigen,培养滤液蛋白10)、ESAT-6(Early secretory antigentic target-6,早期分泌6KD蛋白)以及Rv3878基因,将其插入具有绿色荧光蛋白标记真核表达载体pEGFP-C1和带有His-Tag组氨酸标签的原核表达载体pET-32a,构建重组真核与原核表达载体。然后研究选取RD-1区重要毒力因子CFP-10、ESAT-6及CFP-10-ESAT-6的重组真核表达载体,利用脂质体转染法将其转染至RAW264.7细胞,利用流式细胞术检测转染后不同时间细胞的凋亡率,同时分别在转染24h、36h、48h后提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测转染后不同时间后相关凋亡基因及IL-6、IL-10、IL-12的表达水平。观察CFP-10与ESAT-6单独在胞内表达与共表达形成复合物后在胞内表达所起的作用有何区别,探讨其在胞内表达对宿主细胞的影响为后续研究RD1区蛋白与宿主相互作用提供条件。研究结果显示RD-1区基因成功克隆,成功构建Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6以及CFP-10-ESAT-6、Rv3878重组真核表达载体以及Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6重组原核表达载体,通过倒置荧光显微镜观察CFP-10、ESAT-6以及CFP-10-ESAT-6重组载体成功转染至RAW264.7细胞并在细胞内表达,转染24h、36h、48h后,与空载体对照组相比,CFP-10与ESAT-6重组载体转染组细胞凋亡率显著增加,与CFP-10及ESAT-6重组载体转染组相比,CFP-10-ESAT-6重组载体转染组在转染24h后细胞凋亡率下降但差异不显著,在转染36与48h后显著下降。荧光定量PCR检测结果表明CFP-10与ESAT-6重组载体转染组细胞内一些相关凋亡基因Capase3、Capase7、Capase8、Caspase9、AIF、Bcl-2/Bax、IL-6、IL-10、IL-12等表达水平发生显著变化,CFP-10-ESAT-6重组载体转染组与CFP-10与ESAT-6组结果相反。CFP-10、ESAT-6主要通过调控Caspase酶活性及Bcl-2家族蛋白的表达影响细胞线粒体凋亡途径,但CFP-10/ESAT-6共表达与CFP-10、ESAT-6单独作用对巨噬细胞的凋亡的影响存在显著差异。
【图文】：

分析分枝杆菌 RD-1 区基因的 PCR 扩增扩增得到Rv3871、Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6、Rv38因，其片段长度分别为2065bp、300bp、303bp、288bp、110287bp左右，扩增条带均位置准确，明亮清晰且单一，与预图4.7。将重组质粒用EcoRⅠ和HindⅢ进行质粒PCR及双相一致，且条带单一无杂带，具体结果如图4.8至图4.19。上海生工进行测序。对测序鉴定所得核苷酸序列与Genba1、Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6序列同源性均为17%，第76、212、465、656、770、1296、1378碱基G、C、C、C、T、A、T,7个碱基发生突变，且编码的氨基酸序均为99.83%，1182与1184位碱基C、G突变为A、T,但是其不变，不影响后续实验。Rv3879c序列同源性均为99.69%7、1854、1927碱基C、T、T、C、A、C、A突变为T、C、突变，且编码的氨基酸序列发生改变，可能是扩增产物序。

分析分枝杆菌 RD-1 区基因的 PCR 扩增扩增得到Rv3871、Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6、Rv38因，其片段长度分别为2065bp、300bp、303bp、288bp、110287bp左右，扩增条带均位置准确，明亮清晰且单一，，与预图4.7。将重组质粒用EcoRⅠ和HindⅢ进行质粒PCR及双相一致，且条带单一无杂带，具体结果如图4.8至图4.19。上海生工进行测序。对测序鉴定所得核苷酸序列与Genba1、Rv3872、Rv3873、CFP-10、ESAT-6序列同源性均为17%，第76、212、465、656、770、1296、1378碱基G、C、C、C、T、A、T,7个碱基发生突变，且编码的氨基酸序均为99.83%，1182与1184位碱基C、G突变为A、T,但是其不变，不影响后续实验。Rv3879c序列同源性均为99.69%7、1854、1927碱基C、T、T、C、A、C、A突变为T、C、突变，且编码的氨基酸序列发生改变，可能是扩增产物序。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.618

【参考文献】

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本文编号：2575031