双抗体夹心ELISA与免疫组化法在兔产气荚膜梭菌病诊断中的应用研究

发布时间：2020-02-03 07:26

【摘要】：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)能够引发畜禽各种产气荚膜梭菌病,并且易引起人类食物中毒,气性坏疽,严重影响人类健康,因此对产气荚膜梭菌病的诊断尤为重要。各型产气荚膜梭菌均能产生α毒素,因此α毒素的检测能够为诊断产气荚膜梭菌病提供强有力的证据。本研究对2015年10月到2016年12月期间采集的山东省3个规模化兔场30只疑似产气荚膜梭菌病兔进行诊断。利用临床症状、剖检结果、组织病理学检查对疑似产气荚膜梭菌病兔进行初步诊断;运用细菌分离鉴定、DAS-ELISA法和免疫组化法作为主要方法,对疑似产气荚膜梭菌病兔进行诊断。临床症状观察和剖检结果显示,疑似自然感染产气荚膜梭菌病兔的临床特征和各个器官的病变与产气荚膜梭菌病变特征相符;组织病理学检查结果显示,肝细胞、肾小管上皮细胞颗粒变性、空泡变性,小肠、盲肠黏膜上皮细胞坏死脱落,黏膜下层充血。通过细菌分离,分离到疑似产气荚膜梭菌菌株共计25株,分离率为83.3%,经多重PCR鉴定均为A型产气荚膜梭菌。以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)为捕获抗体建立DAS-ELISA方法,优化反应条件,以α毒素稀释浓度(用小鼠LD50的倍数表示)的自然对数为横坐标,OD450nm为纵坐标,建立标准曲线用于定量检测,对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价并应用于临床检测。优化后的DAS-ELISA方法批内检测变异系数均低于10%,批间检测变异系数均低于12%,结果表明该方法具有良好的重复性和稳定性。运用该方法测定产气荚膜梭菌α毒素含量的最低检测限为0.353倍的小鼠LD50,可有效检测范围为0.353-90.368倍小鼠LD50;以健康兔作为阴性对照,患产气荚膜梭菌病的兔群肠内容物中α毒素水平显著高于健康兔群(P㩳0.05);当疑似产气荚膜梭菌病兔肠内容物OD450nm值大于0.3578时判断为阳性,检测为阳性的病兔有26例,阳性检出率为86.7%。同时采取疑似产气荚膜梭菌病兔的回肠、胃、肾脏、肝脏做免疫组化,验证DAS-ELISA法结果,以至少有一个器官检测到α毒素作为阳性判定依据,检测为阳性的病兔有27例,阳性检出率为90%。以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体为基础,利用免疫组化对30只病兔的16种器官中α毒素的分布进行了检测,在自然感染产气荚膜梭菌病兔的心脏、脾脏、肺脏、盲肠、结肠、膀胱、蚓突、延脑等器官中检测到了α毒素的分布,其中,胃、肝脏、肾脏等组织中α毒素信号较强。综合上述几种方法的检测结果表明:2015年10月到2016年12月期间检测的规模化兔场3起疫情的发生与兔群感染产气荚膜梭菌病相关。本研究为评估兔群感染产气荚膜梭菌情况提供了重要依据,提高了诊断的准确性,为今后本地区该病的诊断和防控提供了理论基础和技术支持。
【图文】：

尿液,脾脏肿大,深黄色,深褐色

19/30 例）；肝脏、胆囊肿大（图3-1C，24/30 例）；脾脏肿大，颜色变为深褐色（图 3-1E，29/30 例）；膀胱严重膨胀，充满大量尿液，尿液呈深黄色（图 3-1A，，27/30 例）。气管出血（图 3-1F，12/30 例）。

组织病理,盲肠,脾脏,肾脏

A:脑（200x）； B:心脏（400x）； C:肝脏（400x）；D: 脾脏（400x）； E:肾脏（400x）； F:盲肠（200x）图 3-2 部分组织病理切片图Fig.3-2 Histopathological section of Part organic
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.291

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