小鼠诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

发布时间：2020-02-04 09:43

【摘要】：本研究旨在利用巢式RT-PCR技术,建立高效检测小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的方法。通过Gen Bank上公布的一系列小鼠诺如病毒的基因序列,设计内、外各一对特异性引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式RT-PCR检测方法,并对临床样品进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法特异性好,最低检出量为1×102copies/L,高于使用参考引物RT-PCR的最低检出量1×105 copies/L,对临床样品检出率为73%,高于使用参考引物普通RT-PCR的检出率(60%),与RT-qPCR方法检出率一致。结果表明,本研究成功建立了一种检测小鼠诺如病毒的巢式RT-PCR方法,并能快速、高效地应用于临床样品的检测,为小鼠诺如病毒的诊断和检测提供了有力的手段。
【图文】：

中国兽医科学第47卷图1巢式PCR检测Fig.1NestedRT-PCRfordetectionofmurinenorovirusM：DNA分子质量标准；1：引物MNV-F1和MNV-R1的扩增产物；2：阴性对照；3：引物MNV-F2和MNV-R2的扩增产物；4：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1：PCRproductusingprimersMNV-F1andMNV-R1；2：Negativecontro；l3：PCRproductusingprimesrMNV-F2andMNV-R2；4：NegativecontrolPlus）12.5L，cDNA2L，补ddH2O至25L。第一轮反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸36s，共25个循环。第二轮反应体系：引物为MNV-F2（10mol/L）、MNV-R2（10mol/L）各0.2L，取第一轮PCR产物1L作为模板，2×TaqMasterMix（DyePlus）12.5L，补ddH2O至25L。第二轮反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸18s，共30个循环。取5LPCR产物经浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳，并用凝胶成像系统（Tanon-3500R）检测结果。1.6PCR产物的克隆与序列分析按凝胶回收试剂盒操作说明回收、纯化大小为309bp的目的片段。按照载体pMD19-T的说明书操作连接并转化至E.coliDH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素（Ampicilli）n抗性筛选，挑取菌落进行PCR鉴定。将阳性菌液送至英潍捷基（Invitroge）n贸易有限公司进行测序，并在NCBI网站上用BLAST在线软件进行核苷酸同源性分析。1.7敏感性与特异性试验巢式PCR特异性试验：分别以小鼠肝炎病毒（mousehepatitisvir，uMsHV）、小鼠白血病病毒（murineleukemiavir，uMsLV）、鼠痘病毒（ectromeliavirus，ECTV）、小鼠仙台病毒（Sendaiviru，sSeV）阳性核酸为模板，用步骤1.5建立的巢式PCR方法进行扩增。巢式PCR敏感性试验：使用NanoDrop2000超微量分光光度计测量重组质粒pEASY-MNV-VP1核酸

感染MNV的情况。研究发现，MNV在体内倾向于在巨噬细胞和树突状细胞内复制［14］。人工感染MNV的野生型小鼠在感染后第24小时，，病毒从最初的小肠近端位置扩散至肺、肝、淋巴结和脾脏；在感染后第72小时，其体内的病毒量比感染初期提高了20倍［15］。虽然目前没有相关研究表明感染MNV对实验小鼠产生明显的病理变化，但是由于MNV最初的复制场所位于小肠且趋向于在巨噬细胞和树突状细胞内复制，所以对于胃肠道疾病和免疫学疾病的研究者来说，要避免使用携带MNV的实验小鼠。传统的MNV检测基于电镜技术和血清学技图3巢式PCR敏感性分析Fig.3ThesensitivitytestofthenestedPCRM：DNA分子质量标准；1～4：分别是1×109～1×106copies/L；5～14：分别是1×109～1×100copies/L；N1、N2：阴性对照M：DL2000DNAMarker；1—4：1×109—1×106copies/L，respec-tivel；y5—14：1×109—1×100copies/L，respective；lNy1，N2：Nega-tivecontr，orlespectively1234N1MN2567891011121314604bp309bp图2应用参考引物进行的普通PCR的敏感性分析Fig.2ThesensitivitytestusingthereferenceprimersM：DNA分子质量标准；1：阴性对照；2～6：分别是1×108～1×104copies/LM：DL2000DNAMarker；1：Negativecontro；l2—6：1×108—1×104copies/L，respectivelyM1234562000bp1500bp1000bp750bp500bp200bp547bp图4巢式PCR特异性分析Fig.4ThespecificitytestofthenestedPCR1：阴性对照，M：DNA分子质量标准；2：MNV；3：MHV；4：MLV；5：SeV；6：ECTV1：Negativecontro；lM：DL2000DNAMarker；2：MNV；3：MHV；4：MLV；5：SeV；6：ECTV1M234562000bp1500bp1000bp750bp

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本文编号：2576299