鸭瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其强弱毒株UL2基因差异分析

发布时间：2020-02-08 16:06

【摘要】：鸭瘟又称鸭病毒性肠炎,是由鸭肠炎病毒引起的常见于鸭、鹅及其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性、高度接触性传染病。该病是一种泛嗜性感染的疾病,感染后发病率及死亡率都很高,给我国的水禽养殖业造成重大的经济损失,严重制约了我国水禽养殖业的发展。鸭瘟病毒基因组庞大,虽然GenBank中已经发表了几个毒株的全基因组序列,但针对各基因的相关研究分析依然很少。本试验从山东高青某鸭场的发病鸭中分离到一株病毒,经PCR鉴定和动物回归试验确定为鸭瘟病毒。根据GenBank中已发表的DEV基因组序列,设计合成了一对扩增UL2基因的特异性引物,分别提取该DEV高青分离株和实验室保存的另一DEV强毒泰安株的基因组DNA后,对UL2基因进行了扩增、克隆及序列测定,并与GenBank中已发表的鸭瘟病毒序列进行比较。序列分析结果显示,这两个毒株的UL2基因都与已发表的DEV强毒序列有相同的特征,而与中国疫苗株VAC株和Clone-03株等弱毒株存在较大的差异,弱毒株的UL2基因都缺失了一个528bp的大片段。这表明该DEV高青分离株具有强毒株的基因型特征,提示弱毒株中UL2基因所发生的大片段缺失很可能与病毒的毒力减弱直接相关。之后我们选取鸭瘟病毒相对保守的UL44基因序列,利用Premier5.0软件设计合成一对荧光定量PCR引物,并对目的基因片段进行扩增、克隆,构建出鸭瘟病毒目的基因的阳性标准质粒,成功建立了检测DEV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法检测灵敏度可达2.7×101个拷贝,与常规PCR相比敏感性提高了100倍;特异性试验显示,该方法只对DEV模板有阳性扩增信号,具有较高的特异性;重复性试验显示,5次重复的Ct值之间的差异在0.6 Ct之内,证明该方法具有良好的重复性。上述所建方法对于临床样品的初步检测结果显示,其敏感性要优于普通PCR,可以成为临床上一种快速诊断鸭瘟的有效手段。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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本文编号：2577551