2株猪源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定及对小鼠致病性的研究

发布时间：2020-02-10 22:03

【摘要】：流感病毒现已遍布世界各地,因猪的种间屏障较低,易形成“人-猪-禽”的传播链,并在此期间发生基因重配,产生新的基因型,威胁公共卫生安全。本研究通过应用RT-PCR和鸡胚接种的方法,对2011年从广西百色市乐业县猪场中分离到的2株H9N2亚型流感病毒进行了生物学特性、分子遗传规律、对小鼠的致病性等方面的研究。根据在NCBI上BLAST的结果确定这2株分离株为H9N2亚型流感病毒,本实验室参考国际命名规则进行,简称为SW/GX/P2/2011和SW/GX/P3/2011。其中,PB2、PB1、PA、 HA、MP、NA、M和NS的核苷酸ORF分别为2280bp、2274bp、2151bp、 1683bp、1497bp、1410bp、982bp和838bp。这2株分离株与近年来广西分离株A/Canine/Guangxi/1/2011和A/Equine/Guangxi/3/2011的核苷酸及氨基酸同源性都在99.0%以上。根据获得的氨基酸序列分析,2株分离株的HA蛋白上第109、161、163、202和203位均高度保守,第234位为亮氨酸L,具有SAa-2,6Gal受体结合特异性,HA裂解位点为-RSSRGLF-,没有多个氨基酸插入,属于低致病性毒株；NA蛋白的第63～65位无缺失,而有的研究认为这3个氨基酸的缺失对于增加病毒的神经氨酸酶活性有帮助,同时也有利于病毒从被感染细胞中释放,其次NA在119、151、276、292以及294等位点没有发生变异,说明SW/GX/P2/2011和SW/GX/P3/2011分离株仍对神经氨酸酶类药物敏感；M2蛋白上的第31位发生了由S→N的突变,表明这两株毒对金刚烷胺类药物产生耐药性；在内部基因中,与致病力有关的基因位点PB2的627、701位,PB1的622、709位,PA的315、515位,NS的92位以及NP的319位与参考毒株相比均保守。通过2株分离株分子进化树和同源性分析显示,HA来源于Y280-like亚系,NA来源于G9-like亚系,M和PB2来源于G1-like亚系,PB1、PA、NS和NP来源于F98-like亚系。对这2株进行鸡胚半数感染量(EID50)试验得出SW/GX/P2/2011和SW/GX/P3/2011的其LgEID50/0.1mL分别为5.02以及5.23。小鼠致病性结果显示,小鼠出现了以肺脏为主的病理变化,病毒能够在肺脏以及鼻甲中复制,但复制水平有一定差异,上呼吸道的鼻甲的复制能力比下呼吸道的肺脏高。2个毒株最低均可使小鼠体重下降6%,但并未能致死小鼠,之后至第8天后逐渐恢复正常体重。
【图文】：

重组病毒,种族,流感病毒,禽流感病毒

图１－２重组病毒的产生Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｖｉｒｕｓ逡逑言，从一个种族传到另一个种族是相当困难的，因为流感病毒具年的香港流感打破了这一常规，禽流感直接跨越了种族屏障感染不及。通过相关研究发现Ａ型流感病毒多基因觉得其宿主特异性，性左右的是宿主表面的病毒受体和血凝素基因序列上的受体结合酸ａ－２，邋３半乳糖巧（ＳＡ邋ａ－２，邋３－Ｇａｌ）和唾液酸ａ－２，邋６半乳糖巧种受体，前一种可Ｗ与禽流感病毒结合，后者则与人流感病毒存在于不同的宿主的呼吸道或消化道上皮细胞，禽类和马的消化，３－Ｇａｌ受体，而人类的呼吸道上皮细胞中有ＳＡ邋ａ－２，６－Ｇａｌ受ＨＡ蛋白上第２２６位氨基酸；禽流感病毒的ＨＡ蛋白第２２６位氨，２２８位为甘氨酸（Ｇｌｙ），易与ＳＡａ－２，３－Ｇａｌ结合，人流感病毒（Ｌｅｕ），２２８丝Ｓｅｒ，ＳＡａ－２，６－Ｇａｌ

酒精,阳性对照,电泳图,产物

：ｍｎ＾５ｍｉｎ一８５％酒精邋５ｍｉｎ一７５％酒精邋５ｍｉｎ一蒸馈水邋５ｍｉｎ。逡逑：苏木素６ｍｉｎ－＾蒸馈水洗至不脱色一＾１％盐酸酒精５ｓｉｎ一蒸馈水清洗至不脱色。逡逑片：八％酒精５Ｓ一８５％酒精５Ｓ一９０％酒精５Ｓ一％％酒逡逑邋Ｉ邋５ｍｉｎ一邋１００％酒精Ｉｌ５ｍｉｎ一二甲苯邋Ｉ邋ｌＯｍｉｎ一二甲苯Ｉｌ定结果逡逑经接种鸡胚后，采集尿囊液并用本实验室流感病毒经过电泳后，样品出现片段大小为６８４ｂｐ的条带，，与收并送测，测序结果与ＮＣＢＩ上传结果比对，鉴定为Ｈ９
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

【参考文献】