不同免疫原对PRRSV诱导中和抗体的影响及SHP1在PRRSV感染中的作用

发布时间：2020-02-15 15:28

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪的繁殖障碍与仔猪的呼吸障碍为特征的病毒性传染病。PRRSV的一个重要生物学特征是对猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophage,PAM)具有亲嗜性。PRRSV特异性中和抗体在抗PRRSV的免疫保护中具有重要作用,同时也是评估猪群PRRS免疫保护水平的指标。因此建立基于PAMs的抗PRRSV的中和抗体的检测方法至关重要,对PRRS的防治具有重要意义。SHP1是肺泡巨噬细胞内的酪氨酸磷酸酶,可抑制TLR信号介导的NF-κB和MARK的激活,从而抑制炎性细胞因子的产生。但有研究表明SHP1却对TLR和RIG-I介导的Ⅰ型干扰素的产生有激活作用。SHP1可通过相反的方式调节促炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的产生。为了研究SHP1在PRRSV诱导的抗病毒免疫反应中的作用,本论文对PRRSV感染后SHP1介导的信号通路进行了初步研究。本试验为建立一种检测猪血清样品中PRRSV诱导的中和抗体的方法,先将收集的标准血清进行灭活处理,取2倍倍比稀释后的被检血清和阴性血清分别与等量病毒液混合,接种到铺单层的PAM细胞,继续培养48h后,收获样品,通过用实验室建立的荧光定量PCR方法测定收获样品的病毒拷贝数来建立抗PRRSV中和抗体的检测方法。为了验证此方法,本研究采集了34份临床样品进行抗PRRSV的中和抗体检测。结果显示,本研究建立并验证了基于PAMs的PRRSV诱导的中和抗体的检测方法,本方法的特异性、重复性较好,可用于评估猪群PRRSV的免疫保护水平。本研究为了进一步评估猪群PRRS免疫保护水平,探讨了不同免疫原对PRRSV诱导的中和抗体产生的影响,将28日龄的健康仔猪随机分成五组,第一组为弱毒苗免疫组,在0d免疫接种PRRSV CH-1R弱毒苗;第二组为灭活免疫原免疫组,在0d免疫接种PRRSV油乳剂灭活免疫原;第三组为先强毒感染再灭活免疫原免疫组,0d免疫接种PRRSV强毒液,7d后再免疫接种灭活免疫原;第四组为先弱毒感染再灭活免疫原免疫组,0d免疫接种PRRSV CH-1R弱毒株,7d后再免疫接种灭活免疫原;第五组为健康对照组。用实验一建立的抗PRRSV的中和抗体的方法对试验组进行检测。结果显示:第一组在免疫后28d时3头猪中有两头猪的中和效价为1:2,在42的时3头猪的中和效价分别为1:32,1:4,1:16。第二组在免疫后28d时3头猪抗PRRSV中和效价均小于1:2,在42的时3头猪的抗PRRSV的中和效价分别为1:4,1:8,1:8。第三组强毒感染后3头猪已表现临床症状,再用灭活免疫原免疫,发现已表现出临床症状的猪只免疫后,病情更加严重,均未产生中和抗体。第四组先弱毒感染再灭活免疫原免疫,免疫后28d时有2头猪中和效价为1:2,42d时有3头猪均为1:2。结果表明单纯PRRSV弱毒苗免疫产生中和抗体水平要比PRRSV感染后再用灭活免疫原免疫要高,单纯PRRSV油乳剂灭活免疫原免疫产生中和抗体水平要比PRRSV感染后再用灭活免疫原免疫要高,单纯PRRSV弱毒苗免疫一次的中和抗体水平要比单纯PRRSV油乳剂免疫原免疫一次的要高。推测PRRSV感染后再用灭活免疫原免疫可能会增强病毒在猪体内的复制,抑制中和抗体的产生。因此感染过PRRSV的规模化猪场,不建议使用灭活苗免疫。为了探究SHP1在PRRSV诱导的抗病毒免疫中的作用,本研究采用200个TCID50的PRRSV感染猪肺巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),分别培养12h、24h、36h、48h后收集细胞及上清,分别设正常细胞对照组、聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,poly I:C)刺激对照组、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激对照组。采用ELISA方法检测PRRSV感染的PAM培养上清中SHP1的蛋白表达情况。用实验室已经建立的实时荧光定量PCR方法对PRRSV感染组和各个对照组中PRRSV复制水平及各组PAM细胞中IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的m RNA转录水平变化进行定量分析,结果显示:激活的SHP1对PRRSV感染后PAM中IRF7、NF-k B、IFN-β的转录有促进作用,对IRF3和TRAF6的转录有抑制作用。用LPS、Poly(I:C)刺激PAM细胞,在12h、24h、36h、48h均能促进IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的m RNA转录水平。LPS刺激PRRSV感染的PAM细胞促进了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的转录,Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM细胞也促进了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1、IFN-β的转录。结果表明激活的SHP1会通过TLR介导的信号通路或未知通路来调节PRRSV诱导的抗病毒免疫反应水平。LPS、Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM细胞会抑制病毒的增殖,增强抗病毒细胞因子的转录水平。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28

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