OPG对破骨细胞分化的影响及其Rho信号转导机制

发布时间：2020-02-19 06:45

【摘要】：为探讨骨保护素(osteoprotegerin,OPG)对体外培养破骨细胞(osteoclast,OC)分化的影响以及Rho信号转导机制,本文采用25 ng/mL M-CSF和30 ng/mL RANKL体外联合诱导RAW264.7细胞分化为OC。在培养过程中添加不同浓度的OPG(0、20、40、80 ng/mL),作用24h,利用TRAP染色观察OC分化过程中的形态学变化、骨吸收陷窝检测细胞的骨吸收活性、免疫荧光检测F-actin环的形成,扫描电镜观察伪足的变化,实时荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,QRT-PCR)检测TRAP、 Cathepsin K、dc42V1、Cdc42V2、Rac1、Rac2、Rac3基因的变化,以及免疫印迹(western blot)检测TRAP、Cathepsin K、PAK1、PAK2、PAK3、LIMK、cofilin相关信号蛋白的表达。结果表明：①用25 ng/mL M-CSF及30 ng/mL RANKL联合诱导RAW264.7细胞形成OC过程中,与OC分化和骨吸收相关的TRAP、Cathepsin K基因及蛋白的表达均显著或极显著上升(P0.05或P0.01)；②OC分化的第3d,加入OPG处理24 h后,能极显著减少OC的数目及骨吸收陷窝面积(P0.01),并且极显著降低与OC分化和骨吸收相关的TRAP、Cathepsin K蛋白的表达(P0.01)；③OPG可以抑制OC的F-actin环的形成,OPG处理组细胞伪足小体(pseudopodia corpuscle)的聚合能力降低,排布散乱,肌动蛋白环(filamentous-actin rings, F-actin rings)、丝状伪足(filopodia)和板状伪足(lamellipodia)数量减少；④OPG可显著或极显著降低OC分化过程中Rho家族的Cdc42V1、Cdc42V2、 Rac2、Rac3基因的表达(P0.05或P0.01),并且显著或极显著降低Rho通路相关蛋白PAK1的Ser144和Thr423位点、PAK2的Ser141和Thr402位点、LIMK1的Thr508位点、LIMK2的Thr505位点的磷酸化水平(P0.05或P0.01),显著或极显著增加cofilin的磷酸化水平(P0.05或P0.01),且随OPG浓度的升高抑制或增加的作用更加明显。结论：OPG能够抑制OC的分化,降低OC的骨吸收活性,并且Rho信号通路参与了OPG抑制OC的分化过程；OPG能够通过抑制Rho家族基因Cdc42V1、Cdc42V2、Rac2、Rac3的表达,下调下游靶蛋白PAK的表达,降低LIMK的磷酸化水平,从而上调cofilin的磷酸化,最终抑制OC的分化成熟。
【图文】：

图１－１－２破骨细胞的伪足逡逑（Ａ）小鼠破骨细胞的肌动蛋白丝罗丹明染色（２0ｘ－＾４0ｘ）逡逑（Ｂ）破骨细胞伪足的形成单个伪足的形成巧伪足丛的形成饼封巧带的形成（４）肌动蛋白环的逡逑形成逡逑

图２－１－２体外培养各时间段破骨细胞ＴＲＡＰ染色（１００Ｘ）逡逑－１－２邋ＴＲＡＰ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｎ邋ｅａｃｈ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔ邋ｏｆ邋ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ邋扣邋ｖｚＹｒｏ邋（Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋】０0ｘ）逡逑细胞分化过程中标志性蛋白ＴＲＡＰ、ＣａｔｈｅｐｓｉｎＫ的表达逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.2

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本文编号：2580945