鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白可溶性原核表达、纯化及免疫原性分析

发布时间：2020-02-23 04:28

【摘要】：传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的3到12周龄雏鸡和青年鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害法氏囊B淋巴细胞而引起患病鸡的免疫抑制,给养禽业造成很大的的经济损失。鉴于VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白和宿主保护性抗原,也是当今研究的热点基因。本试验构建了7个带有不同标签的VP2-LS3(lumazine synthase,LS3)重组原核表达载体,以期在大肠杆菌中表达出高可溶性的VP2-LS3重组蛋白。检测结果显示表达的VP2-LS3重组蛋白具有良好的免疫原性,镜检显示形成了LS3蛋白笼。本试验为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。首先,本试验对7种融合标签的基因序列进行分析,设计Nde I和Bam HI两个酶切位点用于扩增7种融合标签的核苷酸序列(His6-Grifin-TEV、His6-GST-TEV、His6-MBP-TEV、His6-Nus A-TEV His6-γ-crystallin-TEV、His6-Ars C-TEV和His6-Ppi B-TEV)。将7种标签的PCR扩增产物与p MD19-T载体连接转化,经菌液PCR及测序分析鉴定正确后,把正确的7种标签的线性片段和VP2-LS3目的基因与表达载体p ET-21b连接,构建重组表达载体。将构建成功的重组表达载体转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后跑SDS-PAGE电泳分析融合不同标签的VP2-LS3蛋白的表达量和可溶性。筛选出对VP2-LS3蛋白可溶性表达水平较高的融合标签,并进行大量诱导表达。结果显示:除了Ppi B标签,其它标签都不同程度地促进了VP2-LS3蛋白的可溶性表达,其中MBP标签效果最好,可溶性表达水平达到69.5%。其次,利用Ni-NTA Agarose亲和纯化VP2-LS3重组蛋白并用TEV酶酶切获取VP2-LS3蛋白。电镜观察分析VP2-LS3重组蛋白是否形成蛋白笼纳米颗粒。试验结果显示TEV酶可以把His6-MBP标签蛋白与VP2-LS3蛋白分开,获得了高纯度的VP2-LS3蛋白;镜检显示形成了LS3蛋白笼纳米颗粒。最后,将纯化的VP2-LS3重组蛋白与等体积的佐剂乳化,制备基因工程亚单位疫苗免疫家兔,获得兔抗VP2的血清,并对其进行Western blot和间接ELISA分析。Western blot分析结果表明表达的VP2蛋白可与IBDV阳性血清发生反应,而不与阴性对照血清发生反应。间接ELISA检测结果显示制备的兔抗VP2血清效价达到1:12 800。以上试验结果表明体外形成的LS3蛋白笼可以包裹VP2蛋白,而且合成的VP2-LS3重组蛋白具有良好的免疫原性,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。
【图文】：

表达载体,基因载体,识别位点,蛋白酶

因的 PCR 扩增的可溶性表达，在构建的 VP2-LS3 基因载体的 Nin、MBP、γ-crystallin、ArsC、 PpiB、NusA)，在融TEV 蛋白酶识别位点，方便后续标签蛋白的去除，，氨酸标签 His6-Tag (图 1)。

标签,PCR扩增产物,种质,凝胶电泳

图 1 研究中构建的表达载体Fig. 1 Construction of the expression vectors used in this study建的 7 种质粒为模板扩增 His6至 TEV 包含融合标签糖凝胶电泳鉴定，每个标签的片段大小与预期相符合序后比对正确。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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