水貂铜绿假单胞菌分离鉴定及灭活疫苗对水貂生产性能的影响

发布时间：2020-02-23 20:19

【摘要】：水貂出血性肺炎是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.a）引起的一种急性、致死性传染病，主要在夏秋季节暴发，各个年龄段的水貂均易感染，发病率和病死率很高，与水貂病毒性肠炎和水貂犬瘟热一起成为危害水貂养殖业的三大传染病。本实验从2012年在山东和辽宁地区暴发水貂出血性肺炎的疑似病例中，根据分离株的生长特性、生理生化代谢特点以及分子生物学特征，分离鉴定了22株铜绿假单胞菌毒株。并对分离株进行了DNA随机多态性分析和药敏试验，，分析了分离株之间的亲缘关系以及分离株对当前常用治疗药物的敏感性情况。铜绿假单胞菌外膜蛋白F（OprF）在不同血清型的毒株之间高度保守，而且具有很好的免疫原性，是保护性抗原。因此，本研究从患出血性肺炎的病死水貂中分离鉴定得到的铜绿假单胞菌中，通过PCR扩增出OprF基因片段，将该基因克隆到pMD18-T载体进行了测序。将测序正确的目的基因连接到表达载体pET-28a后转化到表达菌株BL21中，通过IPTG诱导、超声裂解、镍柱纯化、SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定得到了大量表达的外膜蛋白OprF，为下一步间接ELISA方法的建立打下了基础。利用纯化的蛋白OprF，对建立间接ELISA方法的条件进行了筛选，确定了间接ELISA外膜蛋白OprF的最佳包被浓度为2μg/mL和血清的最佳稀释倍数为1:4，其他与常规条件相同。筛选出该ELISA检测方法的阳性临界值为0.06，最低检出量为1:256，组内重复性试验变异系数在0.33%～8.27%，组间重复性试验变异系数在1.24%～5.59%，均小于10%，表明该方法具有良好的重复稳定性。建立的ELISA检测方法具有良好的特异性，对本实验保存的其他病原体阳性血清：水貂大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和肺炎克雷伯菌均为阴性。用已经建立的间接ELISA方法检测已知的30份阳性血清，28份为阳性，符合率为93.3%。该方法可以准确的评价出水貂体内各种铜绿假单胞菌血清型的抗体水平，具有应用价值。本研究从选用铜绿假单胞菌的当前主要流行血清型G、B型和肺炎克雷伯菌K1型3种菌株制备成灭活疫苗。免疫了以10%灭活肺炎克雷伯菌为佐剂的疫苗，保护率为83%；免疫了以10%Al(OH)3佐剂的疫苗，保护率为71%；而作为空白对照组，仅注射了生理盐水的第6组小鼠的存活率为33%。相对于传统的Al(OH)3佐剂，肺炎克雷伯菌本身可以作为疫苗成分，保护机体免于该病原菌的感染，同时又兼有良好的免疫调节活性，加强了机体对铜绿假单胞菌的免疫应答，产生了更高的抗体水平和提供了更好的免疫保护，兽医临床具有一定的应用价值。
【图文】：

培养特性,绿色,颜色,固体培养基

篇研究内容第 1 章貂源绿脓杆菌的分离鉴定及生物学。培养特性株菌可以在十六烷三甲基溴化铵培养基上生长齐或者呈波浪状的菌落。产色素的细菌培养基气味。其中呈蓝绿色菌落的有 1 株（5%），呈红褐色菌落的有 7 株（33%），不产色素菌落的有均为革兰氏阴性小杆菌，单个散在或成对出现

铜绿假单胞菌,鉴定结果,胨水,甲基溴

le1.1 Biochemical characteristics of the 22 st 阳性菌数甲基溴化铵培养基生长 22（100%）斜面培养基 42℃生长 22（100%）养基生长 22（100%）白胨水还原 22（100%）测定 19（90%） 21（95%）22（100%） PCR 鉴定胞菌 16S rRNA 保守序列 PCR 检测，所有 22 株扩增出目的条带，多扩增产物进行测序并在离菌株与铜绿假单胞菌同源性为 99.9%，因此可
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.92

【参考文献】