与Rab1A互作的布鲁氏菌效应蛋白的筛选及鉴定

发布时间：2020-03-04 12:14

【摘要】：布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由布鲁氏菌属(Brucella)的布鲁氏菌侵入机体后引起的以流产、发热、多汗、骨关节痛等为主要特征的传染-变态反应性人兽共患细菌病。布鲁氏菌是典型的胞内寄生菌，其胞内生存机制目前尚不十分清楚。布鲁氏菌在宿主细胞内形成复制性菌泡是其在胞内生存和增殖的关键。研究发现布鲁氏菌能够通过分泌效应蛋白募集宿主细胞的小G蛋白来调节复制性菌泡的形成，然而具体的效应蛋白却未可知。 Rab是小G蛋白超家族中最大的一个旁支，被认为是信号调控的分子开关，能够调节囊泡的形成、停靠和转移。前期的实验表明Rab1A在布鲁氏菌胞内寄生中扮演着关键作用。因此我们选择Rab1A作为诱饵蛋白寻找能够调控布鲁氏菌BCV形成的效应蛋白。本课题通过分子生物学手段构建沉默Rab1A的慢病毒载体；重组的慢病毒质粒、包膜质粒、包装质粒三质粒共转染到293T细胞包装慢病毒，转染48h后观察绿色荧光验证病毒包装是否成功。将包装好的病毒转导J774A.1细胞，Western blot检测Rab1A的表达；CFU实验来检测牛种布鲁氏菌2308在沉默Rab1A基因的J774A.1细胞中的存活数量。利用基因克隆方法构建表达载体pGEX-4T-1-Rab1A以及两个点突变复合体pGEX-4T-1-Rab1A[S25N]和pGEX-4T-1-Rab1A[Q70L]；然后IPTG诱导GST融合蛋白的表达，使用琼脂糖亲和介质分离纯化融合蛋白；最后将纯化的融合蛋白和超声破碎的布鲁氏菌上清互作，利用SDS-PAGE电泳和银染确定差异蛋白，质谱分析筛选出效应蛋白。通过免疫共沉淀与免疫荧光实验体外验证Rab1A与筛选出的布鲁氏菌效应蛋白之间存在相互作用。 DNA测序表明沉默Rab1A重组慢病毒质粒构建成功；慢病毒包装实验显示转染细胞48h后荧光显微镜下观察发绿色荧光，表明沉默Rab1A重组慢病毒包装成功；Western blot证明感染该重组慢病毒的巨噬细胞其胞内Rab1A蛋白表达明显降低。CFU结果表明布鲁氏菌感染沉默Rab1A的J774A.1细胞后胞内存活数量显著降低。通过GST Pull-down、质谱及相关生物信息学分析找到与Rab1A互作的效应蛋白HSP70；免疫共沉淀与免疫荧光实验结果进一步证明与Rab1A互作的布鲁氏菌效应蛋白是HSP70。综上所述，我们的实验结果表明，宿主细胞的小G蛋白Rab1A调节布鲁氏菌在胞内的生存，其可能的机制是通过募集布鲁氏菌效应蛋白HSP70来实现。本实验的完成为未来进一步探索Rab1A是否通过HSP70调节布鲁氏菌BCV形成，从而调控布鲁氏菌在宿主细胞内的生存机制奠定了实验基础。效应蛋白HSP70的发现也可能为布病的治疗提供潜在靶点。
【图文】：

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图 1 BCV 胞内形成的模式[43]机体后能够激活机体的天然免疫，此时进入到宿菌都将会被杀死，只有少数的布鲁氏菌存活下来反应，开始在宿主细胞内生存。因为布鲁氏菌脂弱的激发天然免疫或者逃避天然免疫的监视，细要。布鲁氏菌侵入机体后会经历潜伏期、急性期持续性的慢性感染期后将会对布病的治疗产生很菌的胞内机制将会对布病的防控和治疗上起到关键

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也可以是来源于侵入机体的细菌分泌的蛋白，如军团菌的 SidM[54]。图 2 小 G蛋白活性调节模式图2 Rab 蛋白的功能细胞内囊泡的转运是一种可以沿着许多途径的高度有序的定向运输，它起始于工体囊泡的出芽，终止于受体囊泡的膜融合。每个途径都有共同的步骤包括：出芽、转运、粘附、锚定和融合[55]。大量研究表明，Rab 蛋白能够调节囊泡的形成、停靠、运输和转移，但是只有部分 Rab蛋白能够调节囊泡的出芽。细胞内的蛋白在供体细胞器的膜上形成包被蛋白，包被蛋白能够调控囊泡的出芽，并诱导运输囊泡的形成。包被蛋白是可以循环利用的动态分子，它的组装需要小 G 蛋白来帮助完成[56]。大量研究表明，Rab1、Rab5、Rab9 可以通过与效应蛋白的结合在囊泡的出芽阶段发挥功能[57-59]。囊泡出芽完成后，通过肌动蛋白（actin）和微管细胞骨架（microtubule cytoskeleton）两种途径来运输。研究表明 Rab 可通过与马达分子相互作用调控囊泡的运输[60]，目前已经证实 Rab3、Rab4、Rab5、Rab6、Rab8 可以通过与激动纤维和微管蛋白互作来调控囊泡的运输[61-64]。其中 Rab6 是通过与其效应蛋白 Rab 驱动蛋白 6（Rabkinesin 6）互作并通过细胞骨架来指导完成囊泡的运输。囊泡的粘附是个复杂的过程
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61

【参考文献】