重组蓖麻毒素A链与天然蓖麻毒素免疫效果比较分析研究

发布时间：2020-03-15 20:38

【摘要】：本论文从以下两个方面对重组蓖麻毒素A链与天然蓖麻毒素免疫效果进行了比较分析研究。1.制备具有生物活性的重组蓖麻毒素A链(r-RTA)并与天然蓖麻毒素(n-RT)进行毒性比较。根据NCBI公布的RTA序列合成基因片段,并将其克隆于pET-28a载体后,利用大肠杆菌进行原核表达,镍柱亲和层析纯化上清,500 mmol/L咪唑溶液洗脱获得可溶性r-RTA蛋白,通过SDS-PAGE及Western blotting对其进行鉴定并用ELISA测定其免疫原性后,对r-RTA与n-RT进行动物和细胞试验毒性比较研究。结果显示,该r-RTA在上清中表达率为31.2%;每升细菌培养物纯化后可得20mg目的蛋白,纯度≥90%,大小为32kD。其免疫原性约为天然RT的1.27倍;通过获取的n-RT细胞半抑制浓度(IC50为0.01μg/mL)及动物半数致死量(LD50为3.27±0.44μg/kg),以相同浓度进行细胞感染和动物攻毒试验,结果显示,同等剂量下,在细胞试验中,n-RT毒力是r-RTA的2700倍;在动物试验中,n-RT组对动物致死率为40%,r-RTA组动物无死亡。结果表明,单独RTA,在没有RTB协助下,具有一定的毒性作用,但毒力将显著降低。2.本实验进行了重组蓖麻毒素A链(r-RTA)、重组突变蓖麻毒素A链(m-RTA)和天然蓖麻毒素(n-RT)毒力及免疫效果分析。细胞试验中,n-RT毒力约是m-RTA与r-RTA的2700倍。腹腔注射免疫无佐剂的r-RTA、m-RTA和n-RT,免疫过程中小鼠体重均有所减轻,相较于r-RTA组和n-RT组,m-RTA组小鼠体重变化最小。4次免疫以后血清抗体效价均达到10-4以上,以6000μg/kg m-RTA免疫小鼠可对20×LD50剂量蓖麻毒素提供完全保护。该结果表明r-RTA、m-RTA和n-RT对小鼠均有一定毒性,m-RTA刺激小对免疫鼠能提供更好的保护。该研究结果将为开发基于RTA的蓖麻毒素疫苗提供重要数据和理论支撑。
【图文】：

重组质粒,腹腔注射,剂量,小鼠

72h LD50测定小鼠 100%和 0%的死亡率为最大剂量和最小剂量，以定攻毒剂量（2μg/kg、2.5μg/kg、2.9μg/kg、3.5μg/kg、40 只。腹腔注射天然蓖麻毒素，注射当天为 D0，观察ΣP-0.5）计算 LD50[48]。LB/c 小鼠分为 3 组（r-RTA 组、n-RT 组和对照组），每 LD50为攻毒剂量，，腹腔注射同等剂量 r-RTA、n-RT 和、体重变化、临床发病情况及组织病理分析。鉴定目的片段大小为 821bp，与预期结果相符。其测序结表明成功构建了重组克隆质粒。

重组质粒,诱导培养,蛋白,产物

图 1.1(B)重组质粒双酶切鉴定ouble digestion identification of recomoⅠ+BamHⅠ双酶切产物；M，DLtion of recombinant cloning plasmid; 表达及表达量分析mol/L 的 IPTG 诱导培养 4 h，约为 32kD，与预期的蛋白大小量为总蛋白的 31.2%（图 1.2）。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4

【共引文献】