【摘要】：鸡蛋是人类重要的动物蛋白质来源,蛋清也是食品工业和生物医药行业的常用原料。钒(V)是动物的必需微量元素之一,但研究表明过量的钒会导致鸡蛋蛋清哈弗单位(HU)显著降低,这是否导致蛋清的加工特性改变,蛋清质量变差是否与其蛋白质组成改变有关尚不清楚;钒导致蛋清质量变差的机理尚不清楚,有待进一步研究。基于此,本文通过五个试验,开展蛋鸡饲料中钒污染的风险评估,研究蛋鸡饲粮钒对鸡蛋蛋清质量和加工特性的影响及与蛋清蛋白质组成的关系,分析钒对蛋鸡输卵管膨大部的氧化损伤和细胞凋亡等的影响,探索抗氧化剂(茶多酚)对钒不利效应的缓解作用,验证并揭示钒降低蛋清质量的机理,意在为人类食品安全特别是重金属钒的安全剂量和控制提供理论依据,探索缓解钒毒性的科学方法,对保证畜牧业的健康发展有重要意义。主要研究内容及结果如下:试验一:蛋鸡常用能量和蛋白质饲料中钒含量研究本试验目的为调查蛋鸡常用饲料的钒含量,分析钒的安全隐患。试验采集四川省内各大饲料企业和蛋鸡养殖场应用的主要蛋鸡饲料原料129份,包括玉米(20份)、小麦(10份)、麦麸(11份)、米糠(6份);蛋白质饲料:豆粕(20份)、DDGS(12份)、玉米胚芽粕(8份)、喷浆玉米皮(9份)、菜粕(11份)、玉米蛋白粉(9份)和棉粕(13份),利用ICP-MS/MS分析其钒含量。结果表明蛋鸡常用能量饲料中小麦的钒含量最高,为0.02~5.40 mg/kg,其次是麦麸0~1.10 mg/kg、米糠0.07~0.52 mg/kg和玉米0~0.68 mg/kg。蛋白质饲料中,玉米胚芽粕、DDGS和菜粕的钒含量较高,分别为0.17~5.80 mg/kg、0~5.00mg/kg和0.11~4.60 mg/kg;其次是喷浆玉米皮0~3.60 mg/kg,豆粕0~1.60 mg/kg和棉粕0~0.80 mg/kg。能量饲料和蛋白质饲料原料引入的钒约占蛋鸡配合饲料钒总含量一半左右。试验二:蛋鸡饲粮钒水平对鸡蛋蛋清质量的影响本试验目的为研究饲粮中不同水平的钒对鸡蛋蛋清高度和蛋清加工特性的影响。试验分为4个处理组,分别在基础饲粮中添加4个钒水平(V:0、5、10和15 mg/kg),每个处理30个重复,每个重复1只鸡,共计120只67周龄罗曼粉壳蛋鸡。试验期为35d,分别在试验7 d、21 d和35 d采集各处理全部鸡蛋,测定蛋清中钒残留、HU和加工特性。结果表明:(1)饲粮中添加钒会导致蛋清中钒含量显著增加(0、5、10和15 mg/kg钒处理组残留量分别为14.44、36.84、31.65和26.48μg/kg,P0.01),但各处理之间差异不显著(P0.05);(2)饲粮中添加V 5~15 mg/kg造成蛋清HU显著下降(P0.05),10 mg/kg和15 mg/kg处理组显著低于5 mg/kg组,但V 10 mg/kg和15 mg/kg剂量之间无显著差异(P0.05);(3)饲粮钒显著降低蛋清凝胶的硬度、黏性和咀嚼性(线性,P=0.01,P0.01,P=0.01),降低蛋清凝胶凝聚性(二次回归,P0.05)。对蛋清凝胶的保水性和弹性无显著影响(P0.05)。(4)饲粮钒对蛋清的起泡性和泡沫稳定性无显著影响(P0.05)。综上所述,饲粮中添加V 5~15 mg/kg造成鸡蛋蛋清质量显著下降,但10 mg/kg和15 mg/kg剂量之间无显著差异。试验三:蛋鸡饲粮钒对鸡蛋蛋清蛋白质组的影响本试验目的为研究饲粮钒对蛋清蛋白质组成的影响。试验分为3个处理组,分别在基础饲粮中添加3个钒水平(0、5和10 mg/kg),每个处理30个重复,每个重复1只鸡,共计90只67周龄的罗曼粉壳蛋鸡,试验期为35 d。在试验35 d每个处理随机采集24枚鸡蛋,采用iTRAQ方法测定蛋清的蛋白质组学。结果表明:(1)蛋清中总共分离出379种蛋白质,153种蛋白质被成功鉴定;(2)钒导致蛋清中的固有蛋白蛋清溶菌酶(Q6LEL2)表达量显著下降(P0.05),卵固蛋白前体(F1NU63)和卵清蛋白(P01012)2种蛋白质的表达量显著上升(P0.05);(3)饲粮钒导致蛋清中来源于输卵管细胞的蛋白F1NWD0(p63家族蛋白)、信号传导抑制蛋白WD重复蛋白2(E1C7S9)等6种蛋白质表达量显著下降;胞浆肌动蛋白1(P60706)、Beta-2微球蛋白(P21611)、簇蛋白(Q9YGP0)、高尔基体蛋白1(Q02391)等11种蛋白表达量显著上升(P0.05);(4)饲粮中的钒导致蛋清中来源于血液带入的蛋白质中的卵黄蛋白原-2(P02845)和血清白蛋白(P19121)等6种蛋白质表达量显著下降(P0.05),核黄素结合蛋白(P02752)和血清溶菌酶(B8YJT7)等10种蛋白质显著上升(P0.05);(5)除簇蛋白、钙黏蛋白同型物X1、F1P0Z6和血清溶菌酶外,钒对蛋清中差异蛋白质表达量的影响程度随饲粮钒水平增加而提高。综上,饲粮钒改变了蛋清固有蛋白质组成,增加了来源于输卵管细胞脱落和血液渗透带入的蛋白数量。试验四:钒对蛋鸡输卵管膨大部氧化应激与细胞凋亡的影响本试验的目的为研究钒影响鸡蛋蛋清质量的机理。试验分为3个处理组,分别在基础饲粮中添加3个钒水平(0、5和10 mg/kg),每个处理30个重复,每个重复1只鸡,共计90只67周龄的罗曼粉壳蛋鸡,试验期为35 d。在试验35 d时,每个处理屠宰随机屠宰6只鸡,立即取输卵管膨大部测定其钒含量、氧化指标、细胞凋亡、病理损伤及卵清蛋白基因OVAL和p53、Bax、Bcl-2、LATS1、LATS2基因的mRNA和蛋白质表达量。结果表明:(1)饲粮钒能够在蛋鸡输卵管膨大部残留,造成输卵管膨大部中GSH-PX活力和T-AOC显著降低(P=0.01,P=0.02),MDA的含量显著升高(P=0.01),对CAT和T-SOD的酶活力无显著影响(P0.05)。(2)饲粮钒能够导致输卵管膨大部腺泡上皮细胞变性、炎性细胞浸润和腺泡腺扩张,细胞凋亡率显著上升(P0.01)。(3)饲粮钒导致输卵管膨大部卵清蛋白基因OVAL的mRNA表达量显著上升(P0.05)。(4)饲粮钒对蛋鸡输卵管膨大部p53的mRNA和蛋白质表达量无显著影响(P0.05);钒显著降低了输卵管膨大部中Bcl-2的mRNA表达量(P0.05),但对其蛋白质表达量无显著影响(P0.05);钒对Bax的mRNA和蛋白质表达量都无显著影响(P0.05),但可以显著提高Bax/Bcl-2的蛋白质表达量比值(P0.05)。(5)饲粮钒导致输卵管膨大部中LATS1基因的mRNA表达量显著高于对照组(P0.05),蛋白质表达量差异不显著(P0.05);LATS2的mRNA表达量有提高趋势(P=0.08),蛋白质表达量差异不显著(P0.05)。综上,蛋鸡饲粮钒残留在输卵管膨大部,导致氧化损伤,增加细胞凋亡,进而影响输卵管膨大部蛋白质分泌功能,增加输卵管细胞脱落和血液渗透入蛋清中的蛋白质数量,从而引起蛋清蛋白质组成改变。试验五:蛋鸡饲粮添加茶多酚缓解钒对鸡蛋蛋清质量的影响研究本试验目的为研究茶多酚对钒造成的输卵管膨大部氧化应激、蛋清质量和蛋清蛋白质组学变化的缓解效应。试验按照2×2试验设计,设2个钒水平(0和5 mg/kg)和2个茶多酚水平(0和600 mg/kg),共计4个处理组,每个处理30个重复,每个重复1只鸡。共计120只67周龄的罗曼蛋鸡,试验期为35 d。结果表明:(1)蛋鸡饲粮中同时添加钒和添加茶多酚能够减少钒在蛋清中的残留,使其与对照组无显著差异(P0.05);蛋鸡输卵管膨大部中残留量也随茶多酚的添加而降低,但仍然高于对照组(P0.05)。(2)在含5 mg/kg钒的饲粮中额外添加600 mg/kg茶多酚能够缓解钒造成的蛋清HU下降,蛋清凝胶硬度、黏性和咀嚼性下降,使其与对照组差异不显著(P0.05)。蛋清凝胶的弹性、回复性和凝聚性,蛋清蛋白质的起泡性和泡沫稳定性各处理间无显著差异(P=0.37,P=0.73,P=0.06)。(3)在蛋鸡饲粮中同时添加茶多酚和钒与单独添加钒相比,蛋清中24个蛋白质表达发生改变,14个上调,14个下调,其中蛋清固有蛋白卵转铁蛋白(P02789)和卵清蛋白相关蛋白X(片段)(P01013)含量显著下降(P0.05),卵清蛋白相关蛋白Y(I0J179)含量显著上升(P0.05)。同时添加茶多酚和钒与单独添加钒相比得到的蛋清差异蛋白质,和单独添加钒与对照组比较得到的差异蛋白质中有9个蛋白质重叠。单独添加茶多酚使蛋清中21个蛋白质表达发生改变,8个上调,13个下调。GO和KEGG分析显示p53和MAPK可能是茶多酚作用的信号通路。(4)钒导致蛋鸡输卵管膨大部粘膜组织中CAT和GSH-PX酶活力显著下降(P0.01),MDA含量显著上升(P0.01);在加钒饲粮中添加茶多酚以后CAT、GSH-PX和T-AOC的酶活力,MDA的含量都恢复到对照组水平(P0.05)。(5)600 mg/kg的茶多酚能够一定程度上缓解5 mg/kg钒对蛋鸡输卵管病理损伤和细胞凋亡,但不能使其恢复到对照水平(P0.05)。结论:蛋鸡饲粮添加钒5~15 mg/kg降低鸡蛋蛋清高度和凝胶加工特性,这与钒导致蛋清蛋白质组学改变有关。钒导致蛋清中固有蛋白质、来源于输卵管细胞和血液的蛋白质含量改变,其机理可能是饲粮钒随血液循环到达蛋鸡输卵管膨大部,导致膨大部氧化损伤,细胞凋亡上升,从而导致输卵管膨大部上皮细胞分泌功能受损,输卵管膨大部脱落和血液渗透入蛋清中的蛋白质含量改变。添加茶多酚可发挥抗氧化作用,缓解钒对蛋清质量的不利影响。
【图文】：
图 1-1-1 蛋鸡输卵管（各部位尺寸参考刘龙，，2014[9]）e 1-1-1 Oviduct of laying hens (the size referenced by Liu, 90%水、9.7~10.6%的蛋白质、0.03%的脂质以及
-2. 热诱导蛋清蛋白质凝胶化过程示意图（陈彰毅等，20atic representation of heat-induced gelation of egg white protChen et al, 2014[31])受到外在和内在两方面的影响。影响蛋白质凝胶
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S831.5
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本文编号：
2590409
