棉粕寡肽发酵制备及其生物活性和营养特性研究

发布时间：2020-03-20 23:37

【摘要】：目的:研究棉粕寡肽的生产工艺、抗氧化活性、免疫活性以及在黄羽肉鸡饲喂过程中的应用效果。方法:(1)从已报导的可用于棉籽粕固态发酵的芽孢菌属、酵母菌属、乳酸菌属和曲霉菌属中收集菌株,通过酪蛋白平板产蛋白酶初筛、单菌及复合菌固态发酵棉籽粕复筛,从中筛选出适用于固态发酵棉粕制备棉粕寡肽的菌种。(2)以提高棉粕寡肽产量为目标,利用单次单因素试验、正交优化试验和响应面优化试验,确定复合菌固态发酵棉籽粕制备棉粕寡肽的最佳培养基和培养条件。(3)测定棉粕寡肽对自由基的清除作用和对高脂日粮引起的氧化应激模型小鼠肝脏和血清中抗氧化酶活性以及血脂代谢产物的影响,评价棉粕寡肽的抗氧化活性。(4)测定棉粕寡肽在体外对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性、分泌细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、产生NO和刺激脾淋巴细胞增殖、分泌细胞因子IL-2的影响以及在体内对环磷酰胺诱导的免疫抑制模型小鼠免疫器官指数、抗体生成细胞数和血清溶血素水平的影响,评价棉粕寡肽的免疫活性。(5)将60只BALB/c雄性小鼠按体重相近原则分成4组,每组5个重复,每个重复3只。空白对照组(CK):饲喂小鼠基础日粮;棉粕寡肽(CP)试验组低(Ⅰ)、中(Ⅱ)、高(Ⅲ)组:在小鼠基础日粮中用5%、10%、15%的棉粕寡肽替代等量的棉粕连续饲喂30天,研究棉粕寡肽对小鼠生长性能和小肠小肽载体PepT1表达量的影响。(6)选用21日龄健康黄羽肉仔鸡,随机分为4组,每组6个重复,每个重复10只鸡。空白对照组饲喂基础日粮,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别用3%、6%和9%的富含寡肽的发酵棉粕(寡肽含量分别为0.95%、1.90%、2.85%)等量替代基础日粮中的棉粕进行饲喂。研究富含寡肽的发酵棉粕对黄羽肉鸡生长中期(21~42日龄)和后期(43~64日龄)生产性能、饲料表观代谢率、屠宰性能、血液生化指标、免疫性能、抗氧化性能以及对小肠小肽载体PepT1表达量的影响,确定棉粕寡肽在黄羽肉鸡生产应用中的效果。结果:(1)从报导的可用于棉籽粕固态发酵的16株菌中筛选出了两株可高效降解棉籽粕大分子蛋白质生成棉籽粕寡肽的菌株,分别为枯草芽孢杆菌-1和酿酒酵母,其复合固态发酵棉籽粕可将其粗蛋白质的55%降解生成23.72%的棉粕寡肽。(2)确定了复合菌最佳固态发酵培养基为:棉籽粕90%、麸皮10%、糖蜜7%、磷酸氢二钾0.1%,最佳工艺条件为:料水比1∶0.8、装料量为30 g/500 mL三角瓶、发酵温度为30℃、发酵时间为72 h。在以上最佳条件下,棉籽粕经过复合菌固态发酵后,产物棉粕寡肽含量为32.13%,比优化前提高了35.5%。(3)棉粕寡肽具有清除自由基的作用,在浓度为0.5~8 mg/mL范围内,随着棉粕寡肽浓度的增加,其清除自由基的作用和总抗氧化能力都逐渐增强。当浓度为8 mg/mL时,其对DPPH清除率为31.55%、抑制·OH能力为48.97 U/mL、抗O_2~-·能力为84.49 U/L、T-AOC为7.45 U/μL。对高脂日粮引起的氧化应激模型小鼠,灌胃不同浓度的棉粕寡肽均能提高小鼠末期体重,但差异不显著(P0.05)。而高浓度的棉粕寡肽可显著提高小鼠平均日增重(P0.05)。灌胃低浓度的棉粕寡肽对小鼠肝脏中T-SOD、GSH-Px及血清中MDA、HDL-C、LDL-C的影响不显著(P0.05),但可显著提高肝脏及血清中T-AOC、CAT活性(P0.05),降低肝脏中MDA(P0.05)的含量,极显著降低血脂TC、TG(P0.01)的含量。灌胃中、高浓度的棉粕寡肽对提高小鼠肝脏及血清中T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-Px及降低血脂TC、TG、LDL-C的作用都显著(P0.05),并可极显著降低肝脏及血清中MDA(P0.01)的含量。(4)棉粕寡肽具有增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性,刺激淋巴细胞增殖,并能促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α及NO和淋巴细胞分泌IL-2的作用。棉粕寡肽还可以提高环磷酰胺免疫抑制模型小鼠的胸腺、脾脏指数,使抗体生成细胞数和血清溶血素恢复到正常水平,并能增加免疫抑制小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α和免疫球蛋白IgG、IgM的含量。(5)在小鼠日粮中添加棉粕寡肽,可以提高小鼠的生长性能,促进小鼠小肠小肽载体PepT1的表达。(6)在黄羽肉鸡21~42日龄日粮中添加6%或9%的富含棉粕寡肽的发酵棉粕,可以显著提高黄羽肉鸡平均日增重、粗蛋白表观代谢率、血清TP、ALB和甲状腺激素T4含量以及小肠小肽载体PepT1表达量(P0.05)。可显著降低料肉比、血清中T-CHO、BUN、TG和MDA的含量(P0.05)。添加9%的富含棉粕寡肽的发酵棉粕,可显著提高鸡全净膛率、脾脏指数和血清中Ca、GH、IL-2含量以及T-AOC活性(P0.05)。在黄羽肉鸡43~64日龄日粮中添加3%的富含棉粕寡肽的发酵棉粕,可显著提高黄羽肉鸡平均日增重、血清中IgG含量和小肽载体PepT1表达量(P0.05)。添加6%的富含棉粕寡肽的发酵棉粕,可显著提高黄羽肉鸡平均日增重、粗蛋白表观代谢率、血清中TP、ALB、T-SOD、GSH-Px、IL-6、IgM的含量以及小肠小肽载体PepT1表达量(P0.05),并极显著提高血清中免疫球蛋白IgG的含量(P0.01)。添加9%的富含棉粕寡肽的发酵棉粕,可显著提高黄羽肉鸡平均日增重、粗蛋白表观代谢率、胸肌率、脾脏指数、血清中ALB、GH、IL-6、T-SOD以及血清和肝脏中的GSH-Px和T-AOC活性(P0.05),并可极显著提高血清中IgM和IgG的含量以及小肠小肽载体PepT1表达量(P0.01)。添加6%或9%的富含棉粕寡肽的发酵棉粕,可显著降低料肉比、血清中T-CHO、BUN和MDA含量(P0.05)。结论:棉籽粕经枯草芽孢杆菌-1和酿酒酵母混合固态发酵后,可产生32.13%的棉粕寡肽。此棉粕寡肽具有抗氧化活性和免疫活性,可以提高黄羽肉鸡的生长性能和屠宰性能,促进日粮中营养物质的消化吸收,提高机体的免疫力和抗氧化功能。
【图文】：

水解圈,菌株,杆菌,名称

图 1.1 部分菌株在酪蛋白平板上的水解圈Fig.1.1 Hydrolytic ring on the casein plateof some strains表 1.3 产蛋白酶菌株的初筛Table 1.3 Screening of protease producing strains菌株名称 D/d 菌株名称 D/d 菌株名称 D/d草芽孢杆菌-1 3.62±0.02 啤酒酵母 2.24±0.04 植物乳杆菌 ---草芽孢杆菌-2 2.28±0.08 酿酒酵母 2.48±0.02 嗜酸乳杆菌 ---草芽孢杆菌-3 2.46±0.05 假丝酵母 --- 德氏乳杆菌 ---草芽孢杆菌-4 --- 毕赤酵母 --- 乳酸链球菌 ---蜡状芽孢杆菌 2.83±0.04地衣芽孢杆菌 2.19±0.06 黑曲霉不易测量硫曲霉不易测/d”表示水解圈直径与菌落直径的比值；“---”表示不产水解圈。同菌株固态发酵棉籽粕产蛋白酶和酸溶蛋白含量

电泳图,棉籽粕,固态发酵,蛋白质S

接菌种的固态发酵培养基做空白对照，结果如表 1.4 所示。可知，芽孢杆菌属中枯草芽孢杆菌-1、枯草芽孢杆菌-4、蜡粕过程中可产酸性、中性、碱性三种不同蛋白酶，产酶能力杆菌>枯草芽孢杆菌-4。枯草芽孢杆菌-1 在棉籽粕固体培养基/g、中性蛋白酶 1239.06 U/g、碱性蛋白酶 835.28 U/g，说明并通过发酵-酶解作用可将棉籽粕蛋白质中 37.2%大分子蛋白蛋白。酵母菌属中啤酒酵母和酿酒酵母也都能在固态发酵棉。其中酿酒酵母的产酶能力强于啤酒酵母，，并可将 28.1%大 16%的小分子酸溶蛋白。曲霉菌属中黑曲霉和硫曲霉产蛋白酵母菌属。其中，黑曲霉在固态发酵棉粕过程中只产生酸性蛋白酶，也产中性蛋白酶，并且产酸性蛋白酶的能力高于黑棉粕大分子蛋白的能力远高于芽孢杆菌属和酵母菌属，可使4.4%和 48.2%，可产生小分子酸溶蛋白 20.0%和 21.7%。酵前后蛋白质分子量的变化7654321M
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S831.5

【参考文献】