鸡痘病毒E3泛素连接酶基因ORF150编码蛋白与泛素相互作用的初步研究

发布时间：2020-03-21 15:26

【摘要】：泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰之一,在真核生物细胞中广泛存在,参与蛋白质降解、细胞信号转导、细胞周期调控等多种细胞进程。许多病毒也编码泛素系统中的一些组分,形成了扰乱和操纵宿主细胞泛素系统的多种机制。有研究报道,鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)ORF150编码一种E3泛素连接酶类似物,属于N1R/p28基因家族,该家族基因编码蛋白一般都含有DNA结合结构域(KilA-N)和环指结构域(RING finger),具有E3泛素连接酶活性。RING型泛素连接酶一般都具有调控自身泛素化的特点,为研究ORF150编码蛋白是否也受到自身泛素化的调控,本研究构建了ORF150和Ub的真核表达载体,通过免疫共沉淀证明了FPV150蛋白可以发生泛素化修饰;在LMH细胞和293T细胞中进行的激光共聚焦实验结果表明:FPV150蛋白和Ub共同表达后亚细胞定位都发生了改变,两者均由散在分布变为聚集于细胞核周围成团分布,且发生了共定位。为探索FPV ORF150的基因功能,本研究构建了ORF150基因缺失重组病毒。首先利用同源重组和蚀斑纯化的方法在鸡胚成纤维细胞(Chick Embryo Fibroblast,CEF)上构建和筛选了一株用报告基因EGFP替换FPV NX10毒株ORF150基因的重组病毒r FPV-Δ150-EGFP,然后利用Cre/loxP重组酶系统实现了重组病毒r FPV-Δ150-EGFP中EGFP基因的敲除,得到了不带筛选标记的FPV ORF150基因缺失重组病毒r FPV-Δ150。取r FPV-Δ150-EGFP和r FPV-Δ150的F3代测定一步生长曲线,结果显示r FPV-Δ150-EGFP F3和r FPV-Δ150 F3与各自的亲本病毒复制动力学基本一致。将r FPV-Δ150-EGFP、rFPV-Δ150和FPV NX10在CEF上连续传代,分别通过荧光观察、PCR、Western blot和生长曲线的测定鉴定重组病毒的遗传稳定性。r FPV-Δ150-EGFP F6代之后随着病变减少,荧光减少;r FPV-Δ150在F5代后也出现病变显著减少的现象,而野生型病毒未见此现象。PCR鉴定和Western blot检测的结果表明重组病毒r FPV-Δ150-EGFP在传代过程中未发生EGFP基因的丢失,也无野生型病毒的存在;r FPV-Δ150在传代过程中无亲本病毒或野生型病毒的存在。r FPV-Δ150-EGFP F5和r FPV-Δ150 F5与野生型病毒FPV NX10的复制动力学基本一致。利用筛选的重组病毒r FPV-Δ150 F3代,在CEF细胞上研究FPV150蛋白与宿主Ub的相互作用。一方面利用荧光定量PCR技术,分析FPV NX10和r FPV-Δ150接种细胞后1~23 h(每2 h间隔取样)内源性Ub转录水平的差异,结果显示:在大部分观测点,接种r FPV-Δ150组Ub的相对转录水平高于FPV NX10组,在3 h、7 h和21 h时差异显著(p0.05),在17 h、19 h和23h时差异极显著(p0.01),FPV NX10和r FPV-Δ150分别在感染细胞后19 h和15 h引起细胞的Ub转录水平大幅升高,说明FP V在完成一个复制周期之后大量繁殖促进Ub转录。另一方面通过蚀斑测定,分析Ub的过表达对FPV NX10和r FPV-Δ150病毒效价的影响。结果表明,在不影响细胞活性的情况下,Ub的过表达能够使FPV NX10的病毒效价升高,使r FPV-Δ150的病毒效价降低。说明FPV150蛋白通过与Ub相互作用促进病毒复制。本研究对FPV150蛋白和Ub的相互作用进行了初步研究,为鸡痘病毒泛素系统相关基因的功能解析及其与病毒复制之间的关系的深入研究提供实验思路。
【图文】：

的质粒分别转染至两种细GGS-150-Flag 和 pCAGGS，用 PBS 冲洗 2 次，每皿每皿加入 1 mL 0.1% Trito，室温封闭 1 h；加入 1%达，，Mouse anti-Ub (P4D1PBST 洗 4 次，每次 10 min Invitrogen Goat anti-MousST 洗 4 次，每次 10 min；可用激光共聚焦扫描显微镜构建与鉴定bp M 1 2

M 1：DL2000 DNA 分子量标准；M 2：DL15000 DNA 分子量标准；1：pEASY-blunt-150 的 PCR 鉴定 2：空白对照 3：pEASY-blunt-150 EcoRⅠ单酶切；4：pEASY-blunt-150 EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切M 1: DL2000 DNA M arker; M 2: DL15000 DNA M arker; 1: Identification of pEASY-blunt-150 by PCR; 2: Blank control;3: Products from the pEASY-blunt-150 digested with EcoRⅠ; 4: Products from the pEASY-blunt-150 digested withEcoRⅠ and XhoⅠ图 2.2 重组克隆质粒 pEASY-blunt-150 的 PCR 和酶切鉴定Figure 2.2 PCR identification and restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pEASY-blunt-1502.3.1.3 pEASY-blunt-150 的测序结果质粒送博仕生物公司测序后，用 DNAMAN 进行比对，结果显示克隆片段与实验室之前获得的 FPV NX10 毒株 ORF150 基因序列相似性为 100%（图 2.3），与预期相符，可用于后续表达载体的构建。划线部分为引物位置。100075075005000500025001000250
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】

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本文编号：2593536