B亚型禽偏肺病毒的分离鉴定及致病性研究

发布时间：2020-03-22 03:01

【摘要】：禽偏肺病毒(Avian Metapneumovrus,aMPV)的自然宿主是火鸡,其次是鸡。aMPV感染火鸡导致火鸡鼻气管炎(Turkey rhinotracheitis,TRT),引起火鸡严重的呼吸道疾病。aMPV感染鸡导致鸡的肿头综合症(Swollen head syndrome,SHS),单一感染时死亡率较低(5%~10%),但引起产蛋量下降(10%~30%),其更大的危害在于aMPV感染后,常继发其它细菌感染,引起严重的呼吸道症状,死亡率高达25%。目前,除大洋洲以外的世界各地均有该病的报道。我国首次在1999年分离到aMPV,随后流行病学调查表明,我国部分养殖场aMPV的感染率相当高,该病对我国养禽业的危害日益加重。由于aMPV分离非常困难,所以国内关于aMPV的分子生物学特征及致病性鲜有研究,不利于该病的有效防控。本研究将疑似肿头综合症的鸡的鼻甲骨和肺脏研磨后分别种于Vero细胞,盲传5代,观察到有一份接种鼻甲骨样品的Vero细胞变圆、聚堆形成合胞体,具有aMPV典型的细胞病变(CPE)特征,将其命名为LN16。电镜观察负染的LN16分离株的病毒粒子呈现多形性,直径约为50-200 nm,偶见直径为500 nm的病毒粒子,具有典型的副黏病毒的形态特征;亚型特异性的RTPCR检测结果显示,LN16分离株仅扩增出了B亚型特异性条带;进一步扩增和测定了LN16分离株的G基因序列,分析表明其G基因与B亚型aMPV的同源性均高于93.8%,而与A、C和D亚型aMPV的同源性都低于63.7%;进一步利用B亚型aMPV特异性的阳性血清进行间接免疫荧光实验,结果显示感染LN16的Vero细胞有特异性的绿色荧光信号。综合以上结果,表明LN16分离株为B亚型aMPV。为了解LN16分离株的分子特征,设计合成了7对引物测定其全基因组序列。测序结果显示,LN16分离株基因组全长为13,513 bp,编码9个蛋白。将其全基因组序列提交至GenBank(登陆号:MH745147),该序列是第一个鸡源的B亚型aMPV的全基因组序列。与火鸡源B亚型aMPV分离株序列比较发现,LN16分离株的全基因组序列与火鸡源的同源性为97.6%,8个编码基因的同源性为95.1%-98.4%,相对保守,但基因间隔区出现碱基的插入和删除,存在明显差异。为了进一步评价LN16分离株对鸡的致病性,将LN16分别感染3、6、9和15周龄的SPF鸡。观察发现,感染后3-6 d的SPF鸡均出现流鼻涕、甩头、流眼泪及精神萎靡等临床症状,各组的发病率均在70%及以上;感染后2-5 d的SPF鸡出现排毒,第4 d排毒率最高,达到83.6%;感染后的2-5 d,在鼻甲骨、气管、喉头等上呼吸道组织中检测到病毒,偶尔也在免疫器官胸腺中检测到病毒;感染组SPF鸡的胸腺出血,鼻甲骨和肺脏出现炎症等病理变化。这些结果表明,LN16分离株对SPF鸡有明显的致病性。本研究成功地从发病鸡群中分离到一株B亚型aMPV,扩增获得首个鸡源B亚型aMPV的全基因组序列,该分离株对不同日龄的SPF鸡有明显的致病性,这些研究结果丰富了aMPV的流行病学资料,同时也为疫苗等防控产品的研制奠定了基础。
【图文】：

负染电镜,毒株,病毒粒子

农业科学院硕士学位论文第二章 B亚型禽偏肺病毒的分离.2 LN16 分离株的电镜观察将 LN16 分离株病毒粒子负染后，，在电镜下观察呈现多形性，近似球形，直径大约 nm，偶见直径为 500 nm 的病毒粒子（图 2.2）。该病毒形态是典型的副黏病毒形态6 分离株属于副黏病毒科。

病料,RT-PCR检测,亚型,毒株

图 2.2 LN16 毒株的负染电镜观察Fig. 2.2 Electron microscope observation of LN16亚型特异性 RT-PCR 鉴定次的 LN16 分离株培养液，利用亚型特异性引物对其进行的 PCR 产物条带大小约为 387 bp，与 aMPV/B 的阳性到 aMPV/A 和 aMPV/C，该结果证实 LN16 毒株属于 B 亚型
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

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