鸭α、γ、λ干扰素在家蚕中的表达及其抗病毒活性检测

发布时间：2020-03-23 19:57

【摘要】：近些年,我国家禽养殖业稳步发展,作为畜牧业中的重要一环,家禽养殖已经成为部分地区农民的主要收入来源。家禽业养殖模式逐渐从散养转向集约化和规模化,在规模化养殖中家禽病毒性疾病的爆发往往造成巨大的损失,在引起家禽死亡率的病因中病毒所占比例达到36%,水禽则是很多病毒的携带者。干扰素是一种具有强大抗病毒、免疫调节等多功能生物活性的细胞因子,对病毒性疾病有很好的治疗和预防效果。本研究采用基因工程的手段制备了鸭的Ⅰ型(α)、Ⅱ型(γ)和Ⅲ型(λ)干扰素,期望对鸭(禽)类病毒性疾病预防和治疗提供帮助。本研究首先对鸭α、γ、λ干扰素的基因序列进行设计优化,通过化学合成的方法获得基因序列,将鸭α、γ、λ干扰素基因构建到杆状病毒转移载体pVL1393的多克隆位点中,获得重组转移载体pVL1393-DuIFN-α、pVL1393-DuIFN-γ和pVL1393-DuIFN-λ,将重组转移载体与失活拯救型家蚕杆状病毒穿梭质粒reBmBac共转染BmN细胞,收集重组病毒rBmBac-DuIFN-α、rBmBac-DuIFN-γ、rBmBac-DuIFN-λ,用重组病毒感染家蚕幼虫并收获表达产物,并通过PCR、RT-PCR的方法证明了三种干扰素基因均重组到了家蚕杆状病毒基因组中,且随着病毒基因组在家蚕幼虫体内进行了复制和高效的转录。其次,本研究利用CEF/VSV-GFP系统对蚕血淋巴中的鸭α、γ、λ干扰素进行了抗病毒活性检测,即采用微量细胞病变抑制法,在CEF细胞上检测蚕血淋巴中的鸭干扰素对VSV-GFP病毒增殖的抑制效果,抗病毒结果显示蚕血淋巴中表达的重组鸭α、γ、λ干扰素都具有较强的抗病毒活性,重组鸭α、γ、λ干扰素抗病毒效价分别为8.13×10~5U/mL、3.0×10~5U/mL、6.1×10~5U/mL。最后通过空斑筛选对共转染病毒进行纯化,分别获得了高表达三种干扰素的病毒毒种,重组鸭α干扰素效价为(1.9±0.25)×10~6 U/mL,重组鸭γ干扰素效价为(8.65±0.52)×10~5U/mL,重组鸭λ干扰素效价为(1.56±0.1)×10~6U/mL,与未经纯化的重组病毒相比,纯化后的最高表达量的毒株所表达的干扰素效价均有2~3倍的提高。本研究利用家蚕杆状病毒表达系统对鸭的α、γ、λ干扰素进行了高效表达,经检测均由较强抗病毒活性。为廉价鸭(禽)用干扰素的生产奠定了基础,期待对鸭(禽类)病毒性疾病的防控和治疗有所帮助。
【图文】：

干扰素受体,信号通路,参考文献

图 1 干扰素受体信号通路（引自参考文献[25]）Fig.1 The signaling pathway of interferon receptor 干扰素的生物学活性.1 抗病毒作用干扰素最早被发现的功能就是其对病毒复制的抑制作用，但是后续的研究发现素并不直接作用于病毒，而是通过受体激活下游的通路，诱导激活 ISGs 转录表抗病毒蛋白（antiviral proteins）来完成对病毒的抑制作用。干扰素诱导的 ISGs 多种，但是其转录翻译的终产物中目前只有蛋白激酶（PKR）、寡腺苷酸合成S）、黏病毒抗性蛋白（MxA）及 15KDa 的 ISG（IFN-stimulated protein of 15KD5）、病毒抑制蛋白（Viperin）几种研究比较深入[25]。PKR[27]是组成型表达的状态下有少量存在，，但可由 IFN 进一步诱导表达，当 PKR 与病毒的 dsRNA 结会磷酸化翻译起始因子 eIF2α，从而抑制细胞和病毒 mRNA 的翻译，抑制病毒KR 可以特异性地识别并结合病毒相关的 RNA，猜测这种方式可能是机体早期抗病毒反应的关键步骤[28]。OAS 可与病毒 dsRNA 结合，产生 2’-5’寡腺苷酸，

核苷酸序列,密码子,核苷酸序列,重要因素

24密码子适应指数；B：DuIFN-γ基因的密码子适应指数；C码子适应指数A: CAI of DuIFN-α; B: CAI of DuIFN-γ; C: CAI of DuIFN-λ图 2.1 DuIFN-α、DuIFN-γ和 DuIFN-λ基因的密码子适应指数Fig .2.1 CAI of DuIFN-α、DuIFN-γ and DuIFN-λ基因中 GC 含量的也是影响其表达的一个重要因素，，在对核苷酸序列进行密码子优化时将 DuIFN-α、D调整为 53.93%、53.11%和 58.86%，见图 2.2。
【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.3

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