MERS-CoV新型快速检测方法的建立
发布时间：2020-03-24 10:03
【摘要】：中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是一种能引起呼吸性疾病的致死率高的新型人冠状病毒,能感染人、蝙蝠、单峰骆驼、羊驼等。自2012年9月至2018年4月底,WHO共报道了2206例实验室确诊病例,其中787例死亡(死亡率约为35.7%)。在2015年,我国广东省确诊了首例输入性中东呼吸综合征病例,这对我国MERS疫情的防控敲响了警钟。由于目前尚无获批的有效疫苗和治疗药物,及时诊断和隔离是控制该病暴发流行的有效方法。MERS-CoV现有的检测方法多以核酸检测为主,WHO发布的MERS-CoV的实验室确诊程序临时指导文件中推荐使用real-time RT-PCR方法对MERS-CoV进行检测确诊。针对MERS-CoV抗原检测方面,双抗体夹心ELISA、胶体金免疫层析试纸等方法已被建立。但这些方法普遍存在需昂贵的实验设备、流程繁琐费时、易出现假阴性和假阳性的问题。为克服以上检测方法的不足,本研究旨在建立针对MERS-CoV核酸和抗原的简便、快速、特异的新型检测方法。1、MERS-CoV反转录环介导等温扩增核酸可视化(RT-LAMP-VF)检测方法的建立与评价;针对MERS-CoV N基因的保守区设计6条特异性引物,用于环介导等温扩增,扩增产物通过一次性核酸可视化装置直接肉眼观察。RNA转录本及MERS-CoV RNA对RT-LAMP-VF方法进行敏感性评价;RNA转录本、SARS-related coronavirus(SARSr-CoV),HKU4,HKU1,OC43,229E等对其进行特异性评价。结果显示:扩增体系中内引物终浓度为0.4μM时,合成的RNA转录本在61℃恒温扩增30min效率最高。RT-LAMP-VF方法可在35min内特异性检测到2×10~1copies/μL的RNA转录本及1×10~1copies/μL MERS-CoV RNA,且与其他冠状病毒等无交叉反应。2、中东呼吸综合征冠状病毒量子点免疫层析试纸的制备;采用传统的EDC偶联法将羧基化CdTe/ZnSe量子点与抗MERS-CoV RBD的单克隆抗体(mAb/MERS-CoV)共价偶联,通过斑点免疫印迹检验偶联物的活性,以做捕获抗体备用;以马抗MERS-CoV IgG作为检测抗体,在双抗体夹心法原理基础上采用免疫层析技术制备MERS-CoV量子点免疫层析试纸。MERS-CoV假病毒对制备的量子点免疫层析试纸进行敏感性评价,MERS-CoV假病毒、商品化SARS-CoV S1亚蛋白、猪流行性腹泻病毒、H5N1流感病毒病毒样颗粒对其进行了特异性评价。结果显示:5μL QDs在pH=6.4的体系中被46.8μg EDC活化后,能与16μg mAb/MERS-CoV高效率偶联,且偶联物具有良好的生物活性。制备的MERS-CoV量子点免疫层析试纸可在15min内检测到2×5~3TCID_(50)/mL MERS-CoV假病毒,且具有较好的特异性。
【图文】：
呼吸窘迫综合征[27]。全球确诊的 MERS-CoV 感染者的年龄范围在 1-94 岁间（平均年龄为 49 岁），其中 65%的为男性，而大多数住院患者多为患有慢性病和免疫疾病的老年人[8, 20, 28, 29]。Assiri 等人对 47 名感染者进行了临床追踪，研究数据表明 MERS-CoV 的潜伏期为5-6天，并可13-14天时引起人感染[22]。Victor等人收集了37名MERS-CoV阳性患者确诊后三周内的上/下呼吸道分泌物、血液、粪便、尿液样品，进行了病毒含量的测定，证明下呼吸道分泌物中病毒载量最高（平均为 5×10copies/mL），阳性检出率最高[19]。不同于人类，MERS-CoV 感染单峰骆驼多引起上呼吸道症状[30]，且 RT-PC结果显示可在单峰骆驼的鼻拭子、血清中检测到 MERS-CoV 的存在[31]。Mulle等人对中东地区的单峰骆驼进行血清学调查发现，90%的成年单峰骆驼体内存在MERS-CoV 抗体，说明 MERS-CoV 在中东地区广泛分布[32]，但现有的数据显示在南美洲骆驼和双峰骆驼体内未检测到抗 MERS-CoV 的抗体，似乎能感染MERS-CoV 的骆驼只局限于非洲和中东地区[33-35]。
显示出与 Bst 3.0 聚合酶类似的活性，且可以直接检测 DNA 和 RNA，更适用于全血样本的检测研究[66]。传统的 LAMP 扩增产物是通过琼脂糖凝胶电泳来观察，阳性结果为特征性的阶梯状条带[62]。由于这种方法极易造成气溶胶污染，2001 年 Yasuyoshi 等人将镁离子加入反应体系中，利用扩增中产生的焦磷酸根离子可与镁离子形成白色沉淀焦磷酸镁，，将扩增产物可视化[67]。但该方法中镁离子的加入会抑制扩增速率，且通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断阳结果存在一定的误差。随后，研究者又利用 DNA 荧光染料能结合双链 DNA 的特性，将核酸荧光燃料替代镁离子加入反应体系中，在一定波长的激发光下产生荧光读取结果，实现对样品的定性检测[68, 69]。最近几年，很多研究者将 LAMP 与微流体芯片相组合，提高了 LAMP 即时诊断中的实用性[70]。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：
呼吸窘迫综合征[27]。全球确诊的 MERS-CoV 感染者的年龄范围在 1-94 岁间（平均年龄为 49 岁），其中 65%的为男性，而大多数住院患者多为患有慢性病和免疫疾病的老年人[8, 20, 28, 29]。Assiri 等人对 47 名感染者进行了临床追踪，研究数据表明 MERS-CoV 的潜伏期为5-6天，并可13-14天时引起人感染[22]。Victor等人收集了37名MERS-CoV阳性患者确诊后三周内的上/下呼吸道分泌物、血液、粪便、尿液样品，进行了病毒含量的测定，证明下呼吸道分泌物中病毒载量最高（平均为 5×10copies/mL），阳性检出率最高[19]。不同于人类，MERS-CoV 感染单峰骆驼多引起上呼吸道症状[30]，且 RT-PC结果显示可在单峰骆驼的鼻拭子、血清中检测到 MERS-CoV 的存在[31]。Mulle等人对中东地区的单峰骆驼进行血清学调查发现，90%的成年单峰骆驼体内存在MERS-CoV 抗体，说明 MERS-CoV 在中东地区广泛分布[32]，但现有的数据显示在南美洲骆驼和双峰骆驼体内未检测到抗 MERS-CoV 的抗体，似乎能感染MERS-CoV 的骆驼只局限于非洲和中东地区[33-35]。
显示出与 Bst 3.0 聚合酶类似的活性，且可以直接检测 DNA 和 RNA，更适用于全血样本的检测研究[66]。传统的 LAMP 扩增产物是通过琼脂糖凝胶电泳来观察，阳性结果为特征性的阶梯状条带[62]。由于这种方法极易造成气溶胶污染，2001 年 Yasuyoshi 等人将镁离子加入反应体系中，利用扩增中产生的焦磷酸根离子可与镁离子形成白色沉淀焦磷酸镁，，将扩增产物可视化[67]。但该方法中镁离子的加入会抑制扩增速率，且通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断阳结果存在一定的误差。随后，研究者又利用 DNA 荧光染料能结合双链 DNA 的特性，将核酸荧光燃料替代镁离子加入反应体系中，在一定波长的激发光下产生荧光读取结果，实现对样品的定性检测[68, 69]。最近几年，很多研究者将 LAMP 与微流体芯片相组合，提高了 LAMP 即时诊断中的实用性[70]。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【参考文献】
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1 宋铁;钟豪杰;梁立环;康敏;肖和龙;钟昱文;侯杰;王军;柯昌文;张彦平;李剑森;方艳;林锦炎;;中国首起输入性中东呼吸综合征疫情应急处置实践[J];华南预防医学;2015年04期
2 胡纪文;熊建辉;陈卓诚;王贵萍;叶蕾;张大准;;人肺炎支原体抗原量子点免疫层析法的建立[J];中国热带医学;2015年07期
3 迟航;郑学星;盖微微;王
本文编号：2598168
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