抵抗素对RAW264.7细胞NLRP3-NF-κB信号通路的影响研究

发布时间：2020-03-26 00:51

【摘要】：抵抗素是一种炎性细胞因子,能够参与机体的免疫调节,与II型糖尿病和肥胖等多种疾病的发生有关。NLRs(NOD-like receptors),包括NOD1(Nucleotide-binding oligomerization domain 1)、NOD2、NLRP3等是天然免疫系统中的重要受体,可接受多种物质的调控,与多种免疫相关信号通路的激活有关。实验室前期研究表明,抵抗素不影响RAW264.7细胞NOD1的表达,但能促进其NOD2的表达,活化NOD2-NF-κB信号通路并释放IL-6、IL-18、TNF-α等炎性细胞因子,但NOD2并不是抵抗素作用的必需受体。NLRP3受NF-κB的调控并参与炎症过程,是NLRP3炎性体的中心,但目前尚无抵抗素与NLRP3关联的报道,抵抗素能否通过NF-κB信号通路活化NLRP3,启动NLRP3炎性体的组装,尚有待研究证明。因此,利用RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)研究抵抗素对其NLRP3基因和蛋白表达,以及活化NF-κB信号通路促进炎性细胞因子释放的影响,明确抵抗素与NLRP3的作用机制。方法与结果:(1)用终浓度为50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL的抵抗素孵育RAW264.7至预定时间(0h、3h、6h、12h、24h)。运用Real Time-PCR和Western Blot技术分别检测细胞NLRP3、NF-κB的基因和蛋白表达水平,ELISA检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等细胞因子的浓度。结果表明,抵抗素上调RAW264.7中NLRP3及NF-κB基因和蛋白的表达;培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的含量随抵抗素终浓度(50-200ng/mL)的增高及培养时间(0-24h)的延长而增加。(2)设计三条不同的siRNA沉默NLRP3基因,荧光显微镜下检测转染效率,Real Time PCR检测沉默效果。结果发现在转染效率较高的条件下,三条siRNA沉默效果均不好。随后更换为用终浓度为10 nmol/L的MCC950(NLRP3的特异性抑制剂)预处理RAW264.7细胞0.5h,添加200 ng/mL的抵抗素继续孵育24 h,检测NLRP3及NF-κB的基因、蛋白表达变化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的浓度。结果:添加MCC950,RAW264.7细胞中NLRP3基因和蛋白表达水平较抵抗素组极显著下调(P0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的浓度极显著降低(P0.001)。表明NLRP3是抵抗素促进RAW264.7细胞释放促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的关键调控因子,但不影响抵抗素激活NF-κB的表达。(3)用终浓度为25μmol/L的小白菊内酯(NF-κB的特异性抑制剂)预处理RAW264.7细胞1h,添加200 ng/mL的抵抗素继续孵育24 h,检测NLRP3及NF-κB的蛋白表达变化和上清液中IL-6、IL-18、IL-1β和TNF-α的浓度。结果:添加小白菊内酯,RAW264.7细胞中NLRP3和NF-κB蛋白浓度显著降低(P0.001),上清液中TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的浓度显著降低(P0.001)。表明NF-κB是抵抗素促进RAW264.7细胞NLRP3蛋白表达和促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的释放的必需因子。结论:(1)抵抗素促进RAW264.7细胞的NLRP3基因表达上调、蛋白表达增高,激活NF-κB并促进细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等的释放。(2)NLRP3参与抵抗素诱导RAW264.7细胞促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β等的释放过程,但其并非抵抗素激活NF-κB的必需因子。(3)NF-κB是抵抗素诱导NLRP3表达升高和RAW264.7释放促炎细胞因子的关键调控因子之一。
【图文】：

形态图,培养的,形态,细胞形态

Low Density High Density图 2-1 正常培养的 RAW264.7 细胞形态Fig 2-1 Normal cultured RAW264.7 cell morphology：左图为对照组 RAW264.7 细胞低密度时形态；右图为对照组 RAW264.7 细胞高密度时形倍数为 4×10。

形态图,内细胞,形态,细胞

20图 2-2 不同处理下 48h 内细胞形态Fig 2-2 Cell morphology within 48h under different treatment注：上图中，，A 组为对照组 RAW264.7 细胞，B 组为加入抵抗素孵育相应时间的 RAW264.7 细胞第 1 列为 0 h 时的细胞，即传代后处于对数期生长态势良好的细胞；第 2 列为不同组处理细胞 6时的细胞状态；第 3 列为不同组处理细胞 12 h 时的细胞状态；第 4 列为不同组处理细胞 24 h 时的细胞状态；第 5 列为不同组处理细胞 48 h 时的细胞状态。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

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