牛呼吸道合胞体病毒反向遗传操作系统构建的基础研究

发布时间：2020-03-27 06:27

【摘要】：牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是副黏病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属的成员,为有囊膜病毒,其基因组是负链RNA,全长约15000 nt,可转录出10条病毒RNA,并翻译成11种蛋白质,其中9种为结构蛋白、2种为非结构蛋白。BRSV呈世界性分布,在我国的流行也比较普遍。BRSV感染牛如果继发性细菌感染,呼吸系统疾病会更加复杂,是发病牛高度死亡的主要原因,给养牛业带来了巨大的经济损失。疫苗免疫仍是防控该病的有力手段。基于反向遗传技术的病毒基因结构与功能的研究,是揭示BRSV致病机理、免疫保护机制以及病毒的宿主和组织嗜性等相关研究的基础。本研究以BRSV核酸呈阳性的鼻拭子样品LJX31为材料,对BRSV全长基因组进行序列测定,并进行序列同源性及进化树分析,以确定中国流行的BRSV的遗传进化关系。在此基础上构建BRSV反向遗传质粒系统,可用于BRSV反向遗传系统的建立,为BRSV的结构与功能研究奠定基础。全长基因组序列测定和分析结果显示,LJX31全长基因组为15150 nt,5’端非编码区为45 nt,3’端非编码区为161 nt。基因组的编码区位于46-14989 nt,包括NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因。L基因最大,含有6573 nt;NS2基因最小,含有492 nt;NS1、N、P、M、SH、G、F和M2基因全长依次为527、492、1202、869、950、466、840、1902和960 nt。全长基因组序列比对分析显示,LJX31与美国Atue51908株的同源性为96.4%。LJX31的全长基因组存在13个核苷酸的插入和3个核苷酸的缺失。与Atue51908株相比,NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因的同源性为92.1-98.5%。对G蛋白的编码基因序列进行同源性和遗传进化分析显示,LJX31与美国毒株V41的同源性最高、亲缘关系最近,同源性达95.1%,表明LJX31可能来源于美国。为构建BRSV LJX31的反向遗传操作系统,分别构建了基因组全长cDNA质粒,以及N、P、L和M2-1蛋白的真核表达质粒;同时,为了增加拯救病毒对细胞的适应性,本研究构建了BRSV受体蛋白CX3CR1的真核表达质粒。N、P、L、M2-1和CX3CR1这5个蛋白表达质粒作为辅助质粒,与全长基因组cDNA质粒共转染BRSV易感细胞,可进行病毒的拯救。本研究同时构建了基于T7启动子和CMV启动子的全长基因组cDNA质粒PVK-LJX31和PCI-LJX31;N、P和M2-1蛋白的编码基因直接克隆至PCI-neo载体,分别构建表达质粒PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1;L蛋白的编码基因经过密码子优化后克隆至p3xflag-CMV载体,构建表达质粒p3xflag-YH-L;CX3CR1蛋白的编码基因采用PCR方法从牛的肺组织中扩增获得,直接克隆至PCI载体,构建表达质粒PCI-CX3CR1。PVK-LJX31、PCI-LJX31、PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L和PCI-CX3CR1,经酶切和序列分析确定序列正确,这样BRSV LJX31反向遗传系统所需的遗传元件均获得了相应的重组质粒。采用IFA对PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L进行表达验证,结果显示每个质粒转染细胞后,其细胞内表达产物均能与相应的抗体发生反应,表明质粒均能在转染细胞中获得表达。此外,通过微基因组质粒pok(-T7)-W对LJX31基因组的顺式作用元件和调控区以及PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四个辅助质粒的功能进行验证,结果显示,pok(-T7)-W质粒转染细胞后,再用BRSV感染细胞,可在细胞中表达绿色荧光蛋白,表明LJX31基因组的顺式作用元件和调控区是有功能的;而pok(-T7)-W质粒和PCI-N、PCI-P、PCI-M2-1和PCI-YH-L四个辅助质粒共转染细胞时,却不能够在细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,表明PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四个辅助质粒形成RNP复合物的能力、或者RNP复合物的功能有缺陷。综上所述,本研究对BRSV LJX31的全长基因组序列进行测定及分析,并构建了该毒株反向遗传操作系统的遗传元件,包括基因组质粒、辅助质粒及其功能鉴定的方法,为BRSV反向遗传平台的建立打下了坚实的基础。
【图文】：

示意图,示意图,基因组,真核表达载体

中国农业科学院硕士学位论文第二章牛呼吸道合胞体病毒反向遗传系统构建的基础研究2.1.7 辅助质粒的构建BRSV 拯救所必需的辅助质粒包括 N、P、L 和 M2-1 四个蛋白的真核表达质粒，此外为了增加拯救病毒的细胞适应性，本研究增加了一个BRSV受体CX3CR1的表达质粒作为辅助质粒之一。根据测定的 LJX31 基因组全长序列设计引物（表 2-4），，通过 PCR 的方式扩增 N、P 和 M2-1 三个蛋白编码基因的开放阅读框（ORF），并分别克隆至真核表达载体 PCI-neo-的 CMV 启动子下游，分别命名为 PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1（图 2-1）。利用天根公司的 DNA 提取试剂盒，从牛肺组织中获得牛的基因组 DNA。设计引物（表 2-4）从牛的基因组 DNA 中扩增编码受体蛋白 CX3CR1 的 ORF。将 CX3CR1 的 ORF 克隆至真核表达载体 PCI 的 CMV 启动子下游（图 2-1）。将构建成的质粒命名为 PCI-CX3CR1。

示意图,示意图,基因组,全长基因组

表 2-5 p3xflag-YH-L 构建所使用的引物Table2-5 Primers used for the construction of p3xflag-YH-因片段 Primer sequence（5’-3-YH-1ACGACTCACTATAGGCAGCCAAGAGAACAGG-YH-2CAGTCCCTGTTCTCTTGGGTTCAGCTTGCAGAT-YH-3CCGACATCTGCAAGCTGGTCGACTCTAGAGG质粒的构建质粒以及全长基因组顺式作用原件和调控区序列的功基因组由 LJX31 基因组的 5’NTR、3’NTR 以及完整图 2-2 p3xflag-YH-L 构建示意图ig.2-2 Schematic representation for the construction of p3xflag-Y
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.653

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