髓细胞瘤相关A和K亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性

发布时间：2020-03-28 03:37

【摘要】：禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是一种重要的致瘤性反转录病毒,可以引起鸡的多种肿瘤,严重威胁养殖业健康发展。鸡源禽白血病病毒包括A~E,J和K 7个亚群。不同亚群的禽白血病病毒常常具有不同的致病性和致瘤谱,A、B亚群病毒主要诱发经典的鸡淋巴细胞瘤,J亚群病毒主要诱发鸡髓细胞瘤,尽管有时它们也诱发其他类型的肿瘤。近20年来,我国报道和研究了大量的ALV-J引起的髓细胞瘤和血管瘤型禽白血病。然而,对其他亚群的禽白血病的相关报道则相对较少,目前尚未见关于ALV-K诱发的肿瘤病变报道和ALV-A诱发髓细胞瘤的自然病例报道。本研究对湖北某蛋鸡群和某地方品种鸡群的肿瘤病鸡进行了病理学观察、病原分离鉴定和病毒全基因特征分析。在此基础上,通过反向遗传操作技术,拯救出基因背景清楚的病毒并研究病毒的致病性和致瘤特征,通过转录组测序分析,了解ALV-A诱发鸡髓细胞瘤的机制,结果如下:1.自然病例病理学观察及病原检测对病鸡进行了组织学观察和病原学检测。ELISA结果显示,商品蛋鸡场和地方品种鸡自然病例的泄殖腔拭子均呈ALV P27阳性;病理组织学观察显示,来自商品蛋鸡场和来自地方品种鸡养殖场的病鸡均为髓细胞瘤混发淋巴细胞瘤。用ALV-A/B/J的特异性引物进行Multi-PCR检测,蛋鸡病料中扩增出与ALV-A对应的核酸片段,但地方品种鸡病料未扩增出片段。以ALV-env的通用引物进行PCR,从地方品种鸡病料扩增出了相应的片段,测序显示扩增出的env与ALV-K原型株JS11C1高度同源。2.病毒分离鉴定与分离株培养特性取两个鸡群中病变典型的病鸡肝脏组织,制备组织悬液接种DF-1细胞进行病毒分离培养,分别以抗ALV-A的单抗AF3、抗ALV-J的单抗JE9和抗ALV-K SU的单因子血清为一抗进行间接免疫荧光试验。结果,以AF3为一抗,用蛋鸡肝脏组织悬液处理的DF-1细胞和以抗ALV-K SU单因子血清为一抗,用地方品种鸡肝组织悬液处理的DF-1细胞呈亮绿荧光,表明从蛋鸡中分离的病毒为ALV-A,命名为HB2015012;从地方品种鸡中分离的病毒为ALV-K,命名为HB2015032。体外培养试验表明,HB2015012和HB2015032与ALV-J参考毒株HB2010001和HB2015029复制特性相似,且HB2015032可以感染荆江麻鸭鸭胚原代成纤维细胞(DEF)。3.病毒分离株基因组特征测序结果显示,HB2015012和HB2015032的前病毒基因组全长分别为7735bp和7703bp,二者均具有典型的C型反转录病毒结构。序列分析显示,HB2015012和HB2015032的gag和pol基因核苷酸序列均相对保守,但HB2015032的pol基因区域(前病毒基因组第5345位碱基)发生了一个C-T突变,提前形成了一个TAA终止密码子,使得其pol基因编码的蛋白与J亚群禽白血病病毒一样,相对于其他亚群的毒株短22aa;HB2015012和HB2015032的UTR+LTR区核苷酸序列与ALV-J相应区域高度相似,二者的3’UTR+LTR区均包含有完整的DR1,E原件,U3,R和U5区,且U3区均具有2个CAAT boxes、2个Y boxes、2个CArG boxes和2个PRE boxes及1个NFAP-1和TATA box,几乎含有ALV-J原型株HPRS-103 U3区所有的调控序列,另外HB2015032的E原件中(前病毒基因组7250位与7251位碱基间)相对与HPRS-103基因组的7388位碱基处具有1个碱基缺失,形成了一个仅在蛋鸡血管瘤型ALV-J毒株中存在的与血管内皮细胞分化相关的c-Ets-1位点。这些结果表明,HB2015012是由ALV-A与ALV-J重组产生的具有ALV-J3’UTR+LTR的自然重组病毒;HB2015032是ALV-K与ALV-J重组产生的以ALV-J为骨架的K亚群禽白血病病毒,且其E原件可能源自致血管瘤型ALV-J。4.病毒反向遗传体系的建立及病毒拯救将HB2015012和HB2015032前病毒基因全长DNA插入pTopo-Blunt simple载体,构建感染性克隆,转化DF-1细胞,进行病毒拯救。结果成功拯救出了具有感染性的病毒rHB2015012和rHB2015032。体外培养试验显示rHB2015012和rHB2015032均与母本病毒具有相似的体外复制能力。5.rHB2015012和rHB2015032的致病性将rHB2015012和rHB2015032以2×10~3TCID_(50)接种SPF鸡进行病毒致病性试验。rHB2015012接种的试验鸡,肿瘤发生率为65%,其中髓细胞瘤发生率为40%;rHB2015032接种的试验鸡,肿瘤发生率为75%,其中髓细胞瘤发生率为50%。水平传播感染rHB2015012的对照组鸡的肿瘤总体发生率为35%,髓细胞瘤发生率为15%,水平传播感染rHB2015032的对照组鸡的肿瘤总体发生率为55%,髓细胞瘤发生率为20%。表明rHB2015012和rHB2015032均可诱发鸡的髓细胞瘤,且rHB2015032的水平传播及致瘤能力强于rHB2015012。6.ALV-A/J/K及ALV-A、ALV-K自然重组病毒Multi-PCR检测方法建立ALV-K是近年从中国地方鸡群中分离鉴定的一个新亚群,可能由于常常不引起临床症状或仅引起鸡的亚临床症状而被长期忽视。目前尚未见关于其PCR检测方法的报道,本研究建立了针对ALV-A/J/K的Multi-PCR检测方法和针对具有J亚群LTR的重组ALV-A/K毒株的Multi-PCR检测方法。特异性试验和灵敏性试验结果表明,所建立的Multi-PCR检测方法特异性和灵敏性良好,灵敏性均可达10~2copies/μL,可用于临床样本检验。7.rHB 2015012感染及肝脏转录组学分析rHB2015012感染鸡肝脏组织RNA-Seq高通量测序转录组分析,共筛选到1825个差异表达基因(DEG),其中1288个为上调表达基因,537个为下调表达基因。GO和KEGG Pathway注释和富集结果显示,部分差异基因与细胞过程、生物调节、代谢过程及免疫应答反应等重要功能相关。进一步分析显示这些基因主要参与的信号通路有癌症相关通路、破骨细胞分化通路、JAK-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路等。具体而言,癌症相关通路富集到85个DEG,PI3K-Akt信号通路富集到76个DEG,破骨细胞分化通路富集到72个相关的DEG,与造血细胞系相关(Hematopoietic cell lineage)DEG有30个,细胞粘附分子相关(Cell adhesion molecules(CAMs))DEG有36个。其中,破骨细胞分化通路富集的72个DEG使与髓细胞瘤密切相关的JAK-STAT信号通路被激活,Acute myeloid leukemia通路里富集了17个DEG,大多数与阻碍造血细胞分化(block of differentiation)相关,也可能与髓细胞瘤的形成有关。MAPK signaling pathway中P53 signaling pathway处于抑制状态,而PI3K-Akt signaling pathway呈激活状态,可促进细胞原癌基因myc(c-myc)的增殖,促进髓细胞瘤形成。
【图文】：

白血病病毒,粒子直径,病毒粒子,粒子

白血病病毒粒子理化特征病病毒粒子大小不等，粒子直径介于 80~120 nm 之间，主要图 1-1 ALV 分类地位图Fig.1-1 Classification ofALV in Retroviride

结构示意图,禽白血病,亚群,外源性

表 1-2 禽白血病各亚群Table1-2 Subgroups of the avian leukosis virus类型代表株原始宿主外源性 RAV-1 鸡淋图 1-2 禽白血病病毒结构示意图Fig. 1-2 Virion diagram of avian leukosis virusFrom http://so.baike.com/s/tupian/
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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