鸡源禽流感病毒H6N6亚型对小鼠致病性以及在猪和人呼吸道组织复制的研究

发布时间：2020-03-28 11:39

【摘要】：背景和目的:H6N6亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在欧亚大陆野生鸟类和家禽广泛流行,其宿主范围逐渐扩大至哺乳动物猪,部分病毒株甚至获得识别与结合人型的能力,有进化演变成为直接感染人的潜能,对人类健康和公共卫生安全构成潜在威胁,但到目前为止,H6N6亚型禽流感病毒如何跨种间屏障传播哺乳动物和人仍未清楚。本项目应用鸡源禽流感病毒H6N6亚型体内感染小鼠,体外感染猪和人呼吸道组织,观察病毒对小鼠的致病性、在猪和人呼吸道组织复制及其病理变化,同时应用基因测序法,比较H6N6病毒各基因片段的变化,筛选H6N6病毒感染小鼠、在猪和人复制的基因特征,为揭示H6N6亚型禽流感病毒跨种属感染人的潜能及其有利于病毒在人复制的关键分子标记奠定基础。方法:1.流感病毒的扩增及EID_(50、)TCID_(50)检测:将选定待用3株陆禽鸡H6N6亚型禽流感病毒:A/CK/ZZ/346/2014(简称ZZ346);A/CK/JX/20490/2014(简称JX20490);A/CK/ZZ/1923/2015(简称ZZ1923),接种鸡胚扩增,培养48h后收获鸡胚尿囊液。测定EID_(50)、TCID_(50)值以明确BALB/c小鼠体内感染和体外感染猪和人组织所使用的病毒稀释度。2.H6N6病毒体内感染BALB/c小鼠:通过鼻腔内、眼睛途径接种小鼠,接种后每天记录症状和体重,1、3、5、7d分别采集咽拭子,3、5、7d分别安乐处死3只攻毒小鼠,取其肺和气管,一半用于研磨检测病毒滴度,另一半经10%福尔马林固定后,用作HE染色和免疫组化,接种后14d采集其血样,用于检测血清抗体。3.H6N6病毒在体外猪呼吸道组织的复制:取新鲜猪呼吸道组织,将病毒稀释液加入猪呼吸道组织,定时采样取组织培养上清液及组织块用于后期流感病毒的分离与鉴定,另取完整组织块经10%福尔马林固定后,用于HE染色和免疫组化检测病毒抗原。4.H6N6病毒在体外人呼吸道组织的复制:取新鲜人呼吸道组织,将病毒稀释液加入人呼吸道组织,定时采样取培养上清液及组织块用于后期流感病毒的分离与鉴定,另取完整组织块经10%福尔马林固定后,用于HE染色和免疫组化检测病毒抗原。5.流感病毒的分离:将前期实验采集用于分离培养的标本均分两份,一份接种鸡胚,培养48h后收取鸡胚尿囊液,HA试验检测尿囊液中病毒滴度;另一份接种于MDCK细胞,培养72h后收取细胞培养液,HA试验检测细胞液中病毒滴度。6.HI试验检测感染动物血清抗体:小鼠感染后14d,采用眼球采血方法取适量血样,离心取上层血清,应用HI试验检测血清抗体。7.HE染色观察动物、组织感染病毒的病理变化:取上述麻醉安乐处死小鼠的呼吸道组织、体外感染猪和人呼吸道组织,组织固定、切片,常规HE染色,光学显微镜下观察病理变化。8.免疫组化检测病毒抗原:取上述安乐处死小鼠的呼吸道组织、体外感染猪和人呼吸道组织,组织固定、切片,免疫组化染色检测病毒抗原。9.基因测序和筛选关键基因标记:提取病毒RNA,PCR反应扩增,纯化产物,采用Illumina的Solexa系统上机测序病毒全基因,使用全球共享流感数据库(Global initiative on sharing all influenza data,GISAID)准备相关病毒数据,用Bioedit进行序列比较和同源性分析H6N6亚型AIV基因片段的变化,筛选对小鼠致病性以及在猪和人呼吸道组织复制的基因特点。结果:1.小鼠感染实验中,ZZ346病毒株可在小鼠体内有效复制,呼吸道组织研磨液接种鸡胚和MDCK细胞后,病毒分离培养呈阳性;HE染色显示攻毒后小鼠气管中有细胞坏死脱落,肺组织出现炎症反应等现象;免疫组化显示呼吸道气管至肺泡组织细胞内病毒NP抗原阳性。JX20490病毒株感染小鼠后,呼吸道组织研磨液接种鸡胚和MDCK细胞,病毒分离培养结果呈阴性;HE染色显示小鼠攻毒后气上皮细胞坏死脱落,但是肺组织未见明显病理改变;免疫组化显示气管上皮细胞内病毒NP抗原阳性,而肺组织NP抗原阴性。然而,ZZ1923病毒株各项检测均为阴性。攻毒14d的小鼠血样,经HI实验检测,3株病毒的所有小鼠血清样本中均呈抗体阳性。2.流感病毒在猪体外呼吸道复制中,3株鸡H6N6亚型AIV感染后的组织样本,经鸡胚接种后病毒分离检测呈阳性,HE染色显示感染后出现肺局部细胞坏死,免疫组化显示肺泡细胞内病毒NP抗原阳性。3.流感病毒在人体外呼吸道复制中,3株鸡H6N6亚型AIV感染后的组织样本,经鸡胚接种后病毒分离检测呈阳性。ZZ346病毒株感染后的肺组织切片,HE染色显示感染后均出现局部细胞坏死,免疫组化显示细胞内病毒NP抗原阳性,而接种JX20490、ZZ1923病毒株的肺组织切片未出现明显病理改变、未检测出病毒NP抗原。4.基因测序分析,3株鸡H6N6亚型AIV的HA裂解位点模式均为PQIETG/GL,显示单个碱性氨基酸切割位点的特征,属低致病性病毒,3株鸡的HA均出现P186T突变,但唯有ZZ346病毒株的HA158位点有氨基酸缺失以及NA颈区出现11个氨基酸(59-69)缺失。结论:1.鸡源H6N6亚型流感病毒可在小鼠呼吸道有效复制、引发呼吸道炎症病变,表明鸡源H6N6亚型流感病毒可跨种属间屏障直接感染小鼠。2.鸡源H6N6亚型流感病毒可在体外猪组织有效复制,其中ZZ346病毒株均可在猪和人肺组织有效复制,提示该病毒株具有感染猪和人的潜能以及与人型SA-α2,6-Gal受体结合的倾向。3.H6N6亚型AIV的HA裂解位点模式属低致病性病毒,ZZ346病毒株HA出现P186T突变、HA158位点有氨基酸缺失以及NA颈区出现11个氨基酸(59-69)缺失,结合ZZ346病毒株均可在人肺泡组织有效复制的结果,提示上述基因位点改变有助于H6N6亚型AIV在人肺泡组织有效复制。
【图文】：

小鼠,后体,临床症状,变化趋势

病毒 H6N6 亚型对小鼠致病性以及在猪和人呼吸道组织复制的研究 2019 届硕/c 小鼠体内感染实验结果后小鼠临床症状改变及体重变化情况B/c 小鼠接种病毒后，，经观察可见其表现出活动减少、饮乱、呼吸较急促等临床症状，但此类临床症状一般 3-5 后的第一天体重下降，随后缓慢恢复并逐渐升高，其变示。

肺组织,HE染色,无明,炎症反应

36图 1-2 3 株 H6N6 AIV 感染小鼠肺组织 HE 染色结果，200×。A：ZZ346 感染小鼠肺组织出现血管充血、炎症细胞浸润；B：JX20490 感染小鼠肺无明显病变；C：ZZ1923 感染小鼠肺无明显病变D: 阳性对照组：肺组织出现明显的炎症反应；E：空白对照组。Figure 1-2 Results of HE staining in lung tissues of 3 strains of H6N6 AIV infected mice, 200×. Apulmonary tissue of ZZ346 infected mice showed vascular congestion and inflammatory reaction; BJX20490 infected mice showed no obvious lung lesions; C: no obvious pulmonary lesions were found ithe infected mice ZZ1923; D: positive control group; E: blank control group.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65

【相似文献】