纤突蛋白高变区对传染性支气管炎病毒致病性、嗜性以及血清型影响的研究

发布时间：2020-04-01 10:29

【摘要】：传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)可导致禽急性高度接触性疾病,给世界养禽业带来严重的经济损失。IBV为囊膜病毒,属于尼多病毒目(Nidovirale)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)。其最重要结构蛋白之一是纤突蛋白(Spike protein,S protein),该蛋白具有高变的S1亚基和保守的S2亚基。早期研究者将S1亚基氨基端高度变异区域定义为高变区(hypervariable regions,HVRs)。经鉴定5个中和抗原位点与HVRs共定位,且HVRs与受体结合区域(receptor-binding domain)部分重合,因而HVRs可能在IBV细胞组织嗜性、血清型和抗原性等方面发挥作用,而有必要揭示其生物学功能。本研究选择Beaudette和ck/CH/LDL/091022毒株为研究对象。Beaudette毒株是适应Vero细胞生长的无致病性实验室改造毒株,ck/CH/LDL/091022是不适应Vero细胞生长的中国QX样肾型强毒株,且两者不属于同一血清型。本试验利用反向遗传操作系统拯救Beaudette重组毒株。分析比对Beaudette和ck/CH/LDL/091022的HVRs氨基酸序列,分别/同时将ck/CH/LDL/091022的HVR I(50~86 aa)、HVR II(104~140 aa)以及HVR III(274~293 aa)分别/同时替换Beaudette毒株HVR I(50~86 aa)、HVR II(104~138 aa)以及HVR III(272~291 aa)。构建相应载体,经BsmB I或Bsa I酶切,片段连接成基因组全长cDNA分子,体外转录,电转Vero细胞,拯救重组病毒,7株重组病毒分别命名为rHVR I、rHVR II、rHVR III、rHVR I/II、rHVR I/III、rHVR II/III、rHVR I/II/III。7株重组病毒经鉴定,纯化,滴定并检测其致病性、组织嗜性以及血清型等生物学特性。首先,间接免疫荧光和RT-PCR试验结果显示7株重组毒株均可在Vero细胞生长繁殖,但是吸附宿主细胞能力有所下降,表明仅替换HVRs不能改变重组病毒细胞嗜性。其次,中和试验结果显示7株重组病毒与Beaudette毒株仍属于同一血清型,尽管重组病毒与Beaudette毒株之间抗原相关系数随着互换HVRs数目增加而下降,表明仅替换HVRs不足以改变重组病毒血清型。再次,体内感染试验结果显示7株重组病毒分别感染SPF鸡只,鸡只不表现临床症状,无死亡,气管病变评分显著低于ck/CH/LDL/091022组,仅在个别鸡只气管检测到IBV RNA,表明仅替换HVRs未能改变重组病毒组织嗜性和致病性。最后,免疫攻毒试验结果显示7株重组病毒免疫鸡只在ck/CH/LDL/091022毒株攻毒后,可迅速产生IBV特异性抗体,重组病毒免疫鸡只气管和肾脏病毒载量与PBS免疫组相比显著降低,表明7株重组病毒可提供一定的免疫保护。本研究揭示了HVRs生物学功能,并探索新型候选疫苗,为IBV防控提供新思路。
【图文】：

示意图,冠状病毒,示意图,负链

学位论文。该项研究表明，人工单点或同时突变先导序列和一个或多个 T成 RNA(Pasternak et al., 2001)。TGEV 和 MHV 反向遗传系统的建果(Alonso et al., 2002)。因此，这是广泛适用于冠状病毒和部毒，均以负链 RNA 合成起始复制和翻译过程。然而，不连续翻译证实。

元件,移码突变,冠状病毒,核糖体

因组的三分之二，包含两个 ORF，基因的表达依赖于核糖体程序移动。冠状病毒核由于 IBV 序列的完善，发现 ORF1a（11.9 kb）与 ORF1b（8.1 kb）之间有一小段（4然而没有 ORF1b 的亚基因组。这一发现在所有的冠状病毒中均一致(Jacks et al., 1码是应用 IBV1a 与 1b 重叠区域插入报告基因构建体外转录系统或者细胞表达系统ey et al., 1989)。在上述系统中，移码突变的发生率大约为 25~30%，远高于逆转录 5%。然而，IBV 或其他冠状病毒感染细胞内发生移码突变概率无法量化，也无法程中移码突变概率是否稳定。核糖体移码突变依赖于两个基因组 RNA 元件(图 1.4)，即“移动序列（”slippery sequeAAC）和下游发卡结构的假结（pseudoknot）(Brierley et al., 1989)。此外，这两个元也很重要。目前推论，假结结构阻碍了核糖体的延伸。这种阻碍有可能需要核糖体的 P 位滑落，并向延伸相反方向移动一个碱基滑入 A 位，进行常规的转录延伸。研，IBV 移码突变模型也证实核糖体在假结结构处停止(Somogyi et al., 1993)。并且 I验和SARS-CoV直接光谱大数据分析移码突变多肽产物(Baranov et al., 2005)均证实和滑入位点。冠状病毒为何应用核糖体移码突变作为基因表达策略的原因尚未清楚为反转录病毒利用移码突变机制产生固定比例的转录产物，，彼此相近，有利于组装物。因此推断，移码突变可预先表达 ORF1 产物，直到 ORF1a 产物及其细胞环境准备
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855.3

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