金黄色葡萄球菌GapC蛋白B细胞表位的鉴定与分析

发布时间：2020-04-03 01:27

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的重要病原菌,能够引起人的表皮感染、败血症、肺炎、心内膜炎及脓毒性关节炎等,给人类健康造成严重威胁。S.aureus也能引起动物感染,如鸡的皮肤脓疱,牛、羊的急慢性乳房炎,猪的流产、皮炎等,给畜牧业造成巨大经济损失。由于S.aureus耐药菌株大量增加,对S.aureus感染采用抗生素治疗的效果越来越不理想。因而,免疫治疗和免疫预防成为人们防治S.aureus感染的重要手段。研究发现,S.aureus表面保守的具有较高GAPDH活性和转铁蛋白结合活性的表面蛋白GapC具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生良好的体液免疫保护作用,可作为疫苗的候选抗原。但到目前为止,S.aureus GapC蛋白诱导体液免疫应答的B细胞表位尚不清楚。本实验根据已发表的S.aureus GapC基因序列设计引物,通过PCR方法扩增出GapC基因,与pET32a(+)质粒连接,表达重组蛋白GapC。以纯化的rGap C蛋白制成免疫原,肌肉接种6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。通过杂交瘤技术及有限稀释法筛选出2株稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株1F4和2A9,随后对单克隆抗体(mAbs)的亚类、特异性以及对GAPDH酶活性的影响进行了鉴定,并做了被动免疫保护实验。发现2株mAbs均为IgG1型,且能够与S.aureus的rGap C特异性结合,2株mAbs均能够抑rGapC蛋白的活性。用2株mAbs被动免疫小鼠后以S.aureus株攻毒,结果攻毒前静脉注射mAbs的小鼠存活时间比对照组延长。利用噬菌体展示技术对GapC蛋白B细胞表位进行淘选,用夹心ELISA方法筛选亲和力高的阳性克隆并进行DNA测序。经过序列分析,获得了2个分别与mAb2A9和mAb1F4亲和力高的表位~(236)PVATGSLT~(243)和~(272)GYTEDEIV~(279)。人工合成表位基因进行原核表达,并用mAbs对表达产物进行Western blotting分析,其反应性良好。将表位序列的氨基酸进行定点突变,确定了构成2个表位的关键氨基酸分别是P~(236)、G~(240)、L~(242)、T~(243)和G~(272)、D~(276)、E~(277)、I~(278)、V~(279);进一步采用间接免疫荧光试验证明2个表位均暴露在菌体表面;用表位免疫接种小鼠的血清进行调理吞噬实验,血清能够明显增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬细菌的能力;用表位免疫接种小鼠后攻毒,两个表位均能对免疫小鼠提供良好的免疫保护。以上结果为进一步研究表位疫苗提供参考。
【图文】：

组质粒 pMD18-T-gapC 的双酶切及 PCRe recombinant pMD18-T-gapC plasmid by and PCR analysisAMarker; 1: pMD18T-gapC 经 BamHI 和2: PCR 扩增 gapC 基因. 重组质粒的鉴定D18-T-gapC 重组质粒和 pET-32a(+收 pMD18-T-gapC 的目的片段和质杆菌 BL21(DE3)感受态细胞中，，挑1%琼脂糖凝胶电泳结果显示获得的因测序结果与 NCBI 序列同源性为

组质粒 pET-32a(+)-gapC 的双酶切及 PCR 鉴of the recombinant pET-32a(+)-gapC plasmid bydigestion and PCR analysis ladder; 1: pET-32a(+)-gapC 经 BamHI 和 Hind2: PCR 扩增 gapC 基因. Western blotting 鉴定行 SDS-PAGE，蛋白条带大小与预期结并且通过 His-binding-resin 纯化柱纯化estern blotting进一步证实了重组GapC
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.611

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本文编号：2612732