酸马奶源乳酸杆菌代谢物对犊牛肠黏膜屏障作用的研究

发布时间：2020-04-04 23:08

【摘要】：犊牛腹泻是造成奶牛养殖业经济损失的原因之一。本试验前期通过体外抑菌和小鼠体内抗菌试验初步确定了酸马奶源乳酸杆菌代谢物(MLP)的作用效果,为后期研究犊牛肠黏膜屏障的作用提供参考依据。试验1,通过分离鉴定、体外抑菌和SPF小鼠抗菌试验证明了酸马奶源乳酸杆菌具有抑菌效果,并测定其分子量大小和氨基酸组成。试验2,选取60 只 SPF小鼠,随机分为健康组、腹泻组、氨苄青霉素组、环丙沙星组、Nisin组和MLP组。除健康组外,其余5组分别灌胃灭菌生理盐水、氨苄青霉素(0.001 g/kg)、环丙沙星(0.13 g/kg)、Nisin(0.002 g/kg)和 MLP(0.125g/mL),连续 15d,2 次/d,并于第 5d末次给药30 min后腹腔注射浓度为0.5× 10~9 CFU/mL的致病性EcoliO1,再继续灌胃10 d。试验结束后,采集样品,进行微生物-脑-肠轴相关指标检测,研究MLP对感染致病性EcoliO1小鼠微生物-脑-肠轴的作用。试验3,选取20头荷斯坦犊牛,除自然组外,其余3组犊牛经口服接种致病性E.coli O1(2.50 × 10~11 CFU/mL,100 mL/头)建立腹泻模型,造模3 d后,将灭菌生理盐水、0.5 mg/kg环丙沙星和200 mL MLP试验样品混于酸化奶中连续饲喂15 d,2次/d。试验结束后,采集血液分离血清,收集回肠、瘤胃液、盲肠、结肠样品进行相关指标检测,研究MLP对感染致病性E.coliO1犊牛肠黏膜屏障的作用机制。研究结果表明,试验1:从酸马奶中分离鉴定出4株乳酸杆菌,在属的水平上与乳酸杆菌标准菌株相似度达到97.80%,确定为乳酸杆菌并命名为:Lactobacillus.P。通过体外试验确定MLP的最小抑菌浓度(MIC)为62.50mg/mL。MLP中含有丰富的脯氨酸,并测得MLP的分子量在1000 Da以下占到76.46%,确定为细菌素。试验2:MLP使空肠中血小板反应蛋白1和总胆固醇的浓度显著增加,使回肠中胰岛素含量显著降低(P0.05)。MLP可显著增加Lactobacillus的丰度,显著降低Proteobacteria的丰度(P0.01),对调节肠道菌群的动态平衡具有一定的作用。试验3:①腹泻组犊牛回肠绒毛变短、水肿、断裂脱落、肌层厚度减少;而MLP组犊牛肠绒毛排列整齐、紧密,肠黏膜完整,更加接近于自然组。②与自然组、腹泻组和环丙沙星组相比,MLP显著增加血清中IgA、IgG、CD4、IFN-γ的水平,显著增加回肠组织中adamtsl、TC和INS以及犊牛体重,显著增加结肠中Claudin-1、Occludin和JAM-1的浓度;显著降低TNF-α和IL-6的水平,从而增强肠黏膜免疫屏障和机械屏障功能。③通过16S rDNA对瘤胃液、盲肠和结肠微生物测序表明:MLP和环丙沙星一方面增加盲肠、降低结肠中OTUs数量;另一方面,显著增加Porphyronzonas的丰度,显著降低瘤胃液中Helicobacter、盲肠中Faecalibacterium和结肠中Fusobacterium的丰度;从而提高胃肠道黏膜微生物屏障功能。综上所述,MLP可有效改善致病性E.coli O1腹泻性犊牛的免疫力和胃肠道微生物菌群。MLP在改善动物健康和增强免疫力上与动物菌群丰富度有关,口服益生菌代谢物是通过调节胃肠道微生物群来增强肠黏膜免疫屏障的有效途径之一,我们的工作为益生菌代谢物以改善动物和人类健康提供了理论依据。
【图文】：

图１技术路线图逡逑Ｋｉｇ．邋Ｉ邋Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｄｒａｗｉｎｇ逡逑

具有代表性的细菌ＯＴＵｓ序列。通过ＲＤＰ和Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ数据库同源性比对发现约逡逑有５．６７％无法鉴定到属的水平，约有７．８３％无法确定到种的水平。在属的水平上，，逡逑分离株与乳酸杆菌标准菌株相似度达到９７．８０％邋（图２）。基于Ｖｅｎｎ图分析表明，逡逑标准菌株（ＬＰ１）有１０１个特有ＯＴＵｓ序列，酸马奶中分离的乳酸杆菌组（ＬＰ２）有逡逑１０８个特有ＯＴＵｓ序列，而所有样本中所共有４０１个ＯＴＵｓ序列（图３），从而确定逡逑试验所分离的菌株为乳酸杆菌，命名为：心ｃ／／／ｗ．ｖ．Ｐ。逡逑表４疑似乳酸杆菌分离株的１６Ｓ邋ｒＤＮＡ鉴定逡逑Ｔａｂｌｅ．４邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋１６Ｓ邋ｒＤＮＡ邋ｏｆ邋ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ邋Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ逡逑样品编号邋序列（条）邋ＯＴＵ邋（个）门（个）纲（个）目（个）科（个）属（个）种（个）逡逑ＬＰ１－１逦７１９８２逦１９２逦１０逦３逦４７逦８０逦８４逦２２逡逑ＬＰ１－２逦７０３４０逦１９２逦１０逦１逦４７逦８０逦８４逦２２逡逑ＬＰ２－１逦６９８３６逦１９２逦１０逦１逦４７逦８０逦８４逦２２逡逑ＬＰ２－２逦７１６３３逦１９２逦１０逦３逦４７逦８０逦８４逦２２逡逑ｉｎ逡逑Ｉ逦＿＿ｌ逡逑■邋Ｆｕｓｉｃａｔ？ｎｉ0ａｃｔｃｒ逡逑■邋Ｆ＊ｅｃ＊ｌｉｂ？ｃｔｅ
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

【参考文献】

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本文编号：2614183