耐伊维菌素捻转血矛线虫相关分泌性蛋白的研究

发布时间：2020-04-04 23:53

【摘要】：一直以来,家畜胃肠道线虫病的流行十分普遍,其中尤以捻转血矛线虫病为甚,严重影响着畜牧业的健康发展。针对这一情况,人们陆续开发了系列高效、广谱和低毒的驱虫药,但因抗药性问题的产生,使得可用药物的种类越来越少。有效解决这一问题的关键就是及时对耐药性问题做出诊断和明确耐药性的产生机制,但限于研究方法,目前仍没有较为系统的耐药性现状和耐药机理方面的信息。鉴于此,本研究以耐伊维菌素捻转血矛线虫为研究对象,对不同阶段与不同虫株的分泌产物进行Shotgun LC-MS/MS分析,以为揭示捻转血矛线虫的侵染机理、免疫逃避等的研究提供基础信息,并可为疫苗抗原、药物靶点或诊断标记的筛选提供新的思路,对今后捻转血矛线虫的防治研究具有重要意义。具体研究成果如下:(1)研究确定糖盐水漂浮法为捻转血矛线虫虫卵的最佳分离方法,并通过对8种备选培养基的筛选,确定M199培养基为捻转血矛线虫体外培养的最适培养基。(2)通过对捻转血矛线虫培养条件的优化和相应指标的测定发现,在虫体接种密度为30条时,标准耐药株和敏感株成虫最佳培养条件为M199培养基700μL、青链霉素混合液(100×)300μL、两性霉素B(2.5 mg/mL)20μL、伊维菌素(1 mg/mL)10 μL(仅耐药株加入),分泌性蛋白质最佳产生时间为75 h；其第三期脱鞘后幼虫培养体系与成虫一致,分泌性蛋白质收集时间为10 d。(3)采用Shotgun LC-MS/MS技术对第三期脱鞘后幼虫和成虫分泌物进行分析,结果在Uniprot蛋白数据库中共鉴定到分泌性蛋白质161个,发现耐药株特有蛋白质为24个,其中P糖蛋白13、β微管蛋白和乙酰胆碱门控氯离子通道ACC-2与虫体耐药性相关,敏感株特有蛋白质为62个,敏感成虫与耐药成虫共有蛋白质为57个;功能分析表明,这些蛋白质主要参与蛋白质水解、代谢、转录、蛋白质折叠、信号转导、离子输运、电子转运与分子结合等过程。(4)对捻转血矛线虫分泌性蛋白质的Western-blot检验显示,分泌性蛋白质大小在15 kDa～200 kDa不等,且不同虫株和同株不同阶段虫体的分泌性蛋白质之间确实存在差异,其中敏感虫株的条带较耐药株多,成虫较幼虫多。
【图文】：

注：表示差异显著（ＰＣ０．０５）。逡逑进一步通过显微镜观察三种方法所得虫卵悬液中杂质的情况，发现糖盐水漂浮逡逑法所收集到的虫卵回收率较高且所含杂质较少（见图１），盐水离心法收集的虫卵逡逑悬液杂质较多，影响显微镜下对虫卵的观察（见图２）；盐水漂浮与糖盐水漂浮结逡逑合法所得的虫卵悬液较为干净且杂质很少，但其中虫卵数量也较少（见图３）。逡逑榦ｊ逡逑图１糖盐水漂浮法所获虫卵逦图２盐水离心法所获虫卵逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｆｌｏａｔｉｎｇ邋ｍｅｔｈｏｄ邋ｗｉｔｈ邋ｓｕｇａｒ邋ｂｒｉｎｅ逦Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｂｒｉｎｅ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑

法所收集到的虫卵回收率较高且所含杂质较少（见图１），盐水离心法收集的虫卵逡逑悬液杂质较多，影响显微镜下对虫卵的观察（见图２）；盐水漂浮与糖盐水漂浮结逡逑合法所得的虫卵悬液较为干净且杂质很少，但其中虫卵数量也较少（见图３）。逡逑榦ｊ逡逑图１糖盐水漂浮法所获虫卵逦图２盐水离心法所获虫卵逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｆｌｏａｔｉｎｇ邋ｍｅｔｈｏｄ邋ｗｉｔｈ邋ｓｕｇａｒ邋ｂｒｉｎｅ逦Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋ｅｇｇｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｂｒｉｎｅ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.7

【参考文献】

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4 王瑞;张博伦;赵晓慧;杨晓野;杨莲茹;李军燕;马亚囡;李文生;李秀霞;;捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白质的产生及其杀虫作用的研究[J];中国兽医科学;2014年04期

5 董建江;李雨来;;绵羊丝状网尾线虫、捻转血矛线虫、结节虫和疥螨混合感染症的诊治[J];养殖技术顾问;2013年09期

6 严若峰;徐立新;李祥瑞;;捻转血矛线虫纯净3期幼虫制备方法的改进[J];畜牧与兽医;2009年01期

7 荣光;赵军明;郑金海;王新华;薄新文;钟发刚;罗盘琪;任耀军;;捻转血矛线虫虫卵的大量分离纯化[J];中国畜牧兽医;2008年12期

8 郝成;杨晓野;蔡蒸葵;王瑞;张晓东;韩海宾;孙玉卓;;幼虫发育试验对羊毛圆科线虫抗药性的检测[J];中国兽医寄生虫病;2007年06期

9 姜波;杨光友;邓家波;;动物线虫抗药机制研究进展[J];安徽农业科学;2007年29期

10 菅复春;张龙现;宁长申;赵金凤;;兽医临床驱虫药及其应用评价[J];中国畜牧兽医;2006年08期

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本文编号：2614228